一种群体感应型大肠杆菌自裂解系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种群体感应型大肠杆菌自裂解系统及其应用，所述大肠杆菌自裂解系统包括裂解蛋白编码基因、AHLs合成酶编码基因luxI、转录调节因子编码基因luxR及含LuxR

【技术实现步骤摘要】
一种群体感应型大肠杆菌自裂解系统及其应用


[0001]本专利技术涉及一种群体感应系统控制的大肠杆菌自裂解系统，特别涉及群体感应系统组件、突变体、载体、大肠杆菌工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]大肠杆菌表达系统是一种原核生物表达系统，因其成本低、表达产物产量高、操作简便及遗传稳定性好等优点，被广泛用于重组蛋白等的表达。大肠杆菌的表达形式主要包括分泌型表达和胞内表达。分泌型表达主要借助信号肽将重组蛋白等表达产物从胞内引导至细胞周质空间，再借助渗透压的改变或者细胞通透性使表达产物释放到培养液中。尽管这种表达方式有利于重组蛋白等表达产物的正确折叠并提高其可溶性，但分泌型表达往往分泌效率不高，而且分泌的成功率也相对较低。不涉及信号肽的胞内表达尽管避免了重组蛋白等表达产物分泌不确定性问题，但往往存在表达产物胞内累积而引起反馈抑制、重组蛋白易形成无活性包涵体、重组细胞代谢负担重等问题。当前，大肠杆菌表达系统的应用以胞内表达为主。可见，如何实现重组细胞高效裂解是大肠杆菌表达系统应用的关键问题之一。目前，常用的细胞裂解方法分为物理裂解、化学裂解和生物酶法裂解。物理裂解法主要依靠温度、机械力等使细胞结构破损，最常用的方法为超声波破碎法，其优势在于破碎时间短、效率高以及通用性强。但破碎过程中伴随的大量产热会使一部分目的蛋白失活，且需要专门的仪器，操作复杂。化学裂解法是利用有机溶剂破坏脂质双分子层或改变细胞壁或膜的通透性，使胞内物质有选择地释放出来，较物理裂解温和。但缺陷是化学试剂往往对细胞和重组蛋白有较强毒性，也会增加产物后续分离负担，且由于作用靶点的不同，其只能应用于特定类型的细胞。生物酶法裂解是指外源添加水解酶来改变细胞的通透性。由于其生产成本高、通用性差，还存在着不可避免的产物抑制，故不能大规模应用于工业生产。
[0003]由于传统的细胞裂解方法都存在局限性，于是研究人员将基因工程技术与细胞裂解相结合，通过改变细胞的代谢通路来控制细胞裂解。如使用诱导型启动子控制裂解基因的表达，包括诱导剂诱导、温度诱导或是光诱导等。相比于传统细胞裂解方法，诱导裂解法操作简便、安全有效。但传统裂解和诱导裂解都存在一个共同的缺陷，即需要人为监督，不能实现细胞的内源性自控裂解。
[0004]于是，基于合成生物学方法的新型细胞裂解系统越来越受到关注和期待。构建细胞自裂解系统的关键是寻找合适的细胞自调控元件。群体感应(quorum sensing，QS)系统作为一种细胞浓度依赖型的细胞交流系统，其作为基因表达的调控系统已被应用于合成生物学中。革兰氏阴性菌中主要存在以N
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酰基高丝氨酸内酯(N
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acylated homoserine
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lactones，AHLs)为信号分子的群体感应系统。在细胞生长与繁殖的过程中，LuxI型合成酶将酰基侧链与S
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腺苷甲硫氨酸的半胱氨酸基团进行连接反应，从而合成自诱导物AHLs，其可以透过细胞膜进入环境中。当环境中的菌体密度较低时，所产生的AHLs很少，其很快就会被环境所稀释；而随着细菌密度的不断增加，AHLs的浓度也逐渐增高，当环境中的AHLs浓度达到一定阈值时，足够多的AHLs通过自由扩散进入细胞内，与细胞内的转录调节因子LuxR
(AHLs受体蛋白)结合，形成LuxR
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AHL复合物，再结合到luxI基因上游启动子上的一段特征序列(“lux box”，5
’‑
NNCT
‑
N
12
‑
AGNN
‑3’
)上，促进luxI启动子下游AHLs合成酶编码基因luxI的转录，产生更多的LuxI型合成酶，合成更多的自诱导物AHLs，进而形成一个级联放大的正反馈系统。可见，这类群体感应系统中的luxI基因及其启动子和LuxR编码基因可以作为有用的元件来构建细胞密度依赖的自调控系统。近年来，已有研究将群体感应元件组合来调控细胞的生理代谢以及构建群体感应相关的代谢通路开关，但目前尚没有将群体感应控制的细胞裂解系统应用于大肠杆菌重组蛋白的表达和释放。
[0005]噬菌体裂解酶是能够水解细菌细胞壁中肽聚糖的一类细胞壁水解酶，对细菌的细胞壁具有非常高的特异性。裂解酶E(lyase E)由噬菌体phiX174产生。研究表明，噬菌体phiX174可以在感染宿主后的短时间内裂解细胞。噬菌体phiX174感染宿主细胞时，裂解酶E作用于革兰氏阴性菌细胞膜上，从而形成一个直径为40～90nm的跨膜孔道结构。由于细胞内外渗透压存在差异，导致细胞膜内含物全部由通道排出胞外，形成无核酸、核糖体以及其它细胞器的空壳结构，名为细菌菌蜕(bacterial ghost)。该空壳结构仍类似于天然细菌的细胞形态，肽聚糖层、外膜蛋白、粘附素和脂多糖等细胞膜结构还会被保留，因此，细菌菌蜕可作为递送药物及核酸的载体，广泛用于多种致病菌(如胸膜肺炎放线杆菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌和新城疫病毒菌)疫苗的制备。可见，用裂解酶E作用重组大肠杆菌，形成重组大肠杆菌菌蜕，一方面有利于胞内表达产物的释放，另一方面可以避免重组大肠杆菌完全裂解成碎片，由此影响后续产物的分离纯化。

技术实现思路

[0006]本专利技术为了克服传统大肠杆菌细胞破碎方法存在的需要人为操作和监管、成本增加、表达产物受损等问题，通过合成生物学的技术来利用和改造群体感应相关元件，使得裂解酶E编码基因表达受细胞密度调控，开发一套人工群体感应系统控制的大肠杆菌自裂解系统，实现重组蛋白的高效表达和释放。
[0007]为达到本专利技术目的，采用的技术方案是：
[0008]本专利技术提供一种群体感应型大肠杆菌自裂解系统，所述大肠杆菌自裂解系统包括裂解蛋白编码基因、AHLs合成酶编码基因luxI、转录调节因子编码基因luxR及含LuxR
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AHLs复合物结合区域luxI的启动子PluxI；所述裂解蛋白编码基因由启动子PluxI调控。
[0009]优选的，所述AHLs合成酶编码基因luxI选自革兰氏阴性菌交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)B3中的yasI基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述转录调节因子编码基因luxR为交替假单胞菌B3中的yasR基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；启动子PluxI为交替假单胞菌B3中的PyasI启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)B3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5353，保藏日期2011年10月17日，已在专利申请CN102367430A中公开。
[0010]优选的，裂解蛋白编码基因源自噬菌体M的M
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lysis(NC_019707)、噬菌体(NC_001422)的裂解蛋白mE(643bp～843bp)或裂解蛋白E编码基因(568bp～843bp)中的一种，优选噬菌体的裂解蛋白E编码基因，更优选所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种群体感应型大肠杆菌自裂解系统，其特征在于，所述大肠杆菌自裂解系统包括裂解蛋白编码基因、AHLs合成酶编码基因luxI、转录调节因子编码基因luxR及含LuxR
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AHLs复合物结合区域的luxI启动子PluxI；所述裂解蛋白编码基因由启动子PluxI调控。2.如权利要求1所述群体感应型大肠杆菌自裂解系统，其特征在于，所述AHLs合成酶编码基因luxI核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述转录调节因子编码基因luxR核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；启动子PluxI核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1所述群体感应型大肠杆菌自裂解系统，其特征在于，裂解蛋白编码基因源自噬菌体M的M
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lysis、噬菌体的裂解蛋白mE或裂解蛋白E编码基因中的一种。4.如权利要求3所述群体感应型大肠杆菌自裂解系统，其特征在于，所述裂解蛋白编码基因为噬菌体的裂解蛋白E编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。5.如权利要求1所述群体感应型大肠杆菌自裂解系统，其特征在于，所述启动子PluxI为下列核苷酸序列之一的PyasI启动子突变体：SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25...

【专利技术属性】
技术研发人员：余志良，孟秋，音建华，朱廷恒，赵怡帆，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：