一种提高CRISPR/Cas基因编辑效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高CRISPR/Cas基因编辑效率的方法，属于基因工程技术领域。首先将pCas质粒及pTox质粒转入宿主菌，pCas质粒中插入有Cas基因和lambda Red基因，pTox质粒中插入有毒性基因，再将pgRNA质粒与外源DNA共同转入上述宿主菌，pgRNA质粒中插入有靶向目标基因gRNA_1和靶向pTox质粒的抗性基因的gRNA_2；pCas质粒表达的Cas蛋白与pgRNA质粒转录的gRNA_1组合对目标靶向位点进行DNA剪切，lambda Red系统结合外源DNA实现基因重组，Cas蛋白与gRNA_1组合后未对目标靶向位点进行DNA剪切，宿主菌中pTox质粒表达有毒物质，从而去除未经基因编辑的宿主菌，保留经基因编辑的宿主菌。此方法不仅可提高单个靶向位点的基因编辑效率，也能提高基因敲除、大片段DNA插入及重组效率，提高高通量基因编辑的效率。提高高通量基因编辑的效率。提高高通量基因编辑的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种提高CRISPR/Cas基因编辑效率的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种提高CRISPR/Cas基因编辑效率的方法。

技术介绍

[0002]Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR
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associated(Cas)是细菌或古细菌特有的一种获得性免疫系统，自从研究人员将其改造为基因编辑工具之后，借助CRISPR/Cas系统高效的基因编辑能力，迅速加快了我们对生命科学、生物工程、医学、农业科学等多个领域的认知。然而，在使用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a(或称为CRISPR/Cpf1)基因编辑技术进行基因改造时，在不同的条件下针对不同的靶向基因位点，存在基因编辑效率不一的问题。
[0003]大肠杆菌(E.coli)是研究广泛的模式细胞，基因操作工具丰富，产物合成途径及过程强化研究积累较多，CRISPR基因编辑技术在大肠杆菌中应用较为广泛。2013年，Jiang等(Jiang W,Bikard D,Cox D,Zhang F,Marraffini LA.RNA
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guided editing of bacterial genomes using CRISPR
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Cas systems.Nature Biotechnology 2013；31(3):233
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9.)首先将CRISPR/Cas9系统在大肠杆菌开展基因编辑工作，通过Cas9与gRNA结合识别剪切目标靶点，将外源的供体DNA序列通过λ
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Red重组系统实现基因整合，编辑效率达到65％。2015年，中国科学院上海生命科学研究院杨晟团队构建了CRISPR/Cas9基因编辑双质粒系统(Jiang Y,Chen B,Duan C,Sun B,Yang J,Yang S.Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR
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Cas9 system.Applied and Environmental Microbiology 2015；81(7):2506
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14.)，可针对多达3个位点进行多基因的敲除及插入。同年，天津大学赵学明团队改造了CRISPR/Cas9系统(Li Y,Lin Z,Huang C,Zhang Y,Wang Z,Tang Y,Chen T,Zhao X.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR
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Cas9 meditated genome editing.Metabolic Engineering 2015；31:13
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21.)，使其可进行迭代基因编辑，从而降低多基因编辑的循环时间。2016年，Bassalo等(Bassalo MC,Garst AD,Halweg
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edwards AL,Grau WC,Domaille DW,Mutalik VK,Arkin AP,Gill RT.Rapid and efficient one
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step metabolic pathway integration in E.coli.ACS Synthetic Biology 2016；5(7):561
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8.)对基于CRISPR/Cas9系统的长片段DNA整合技术进行优化，可一次将10kb的DNA片段整合至基因组。2018年，Li等采用将大片段分割成多个片段整合的方法，使用优化的CRISPR/Cas9系统(Li Y,Yan F,Wu H,Li G,Han Y,Ma Q,Fan X,Zhang C,Xu Q,Xie X,Chen N.Multiple
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step chromosomal integration of divided segments from a large DNA fragment via CRISPR/Cas9 in Escherichia coli.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology 2019；46(1):81
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90.)，成功将长度为15kb的大片段多轮整合至大肠杆菌基因组。
[0004]目前，大肠杆菌CRISPR基因编辑主要是在提高CRISPR基因编辑效率、单细胞多位点基因敲除及插入、长片段DNA基因整合等方面开展研究工作。而微生物细胞代谢具有高度
复杂性，细胞工厂的构建往往需要对微生物元件进行大量的“设计
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构建
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测试”，因此，开发高效的高通量CRISPR基因组编辑技术是十分具有挑战性的工作。而大量的“设计
‑
构建
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测试”对高通量CRISPR基因组编辑技术在DNA高通量合成与文库构建、高通量基因组编辑、文库筛选以及基因型
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表型追踪等方面都提出了很高的要求。Liu等(Liu RM,Liang LL,Choudhury A,Bassalo MC,Garst AD,Tarasava K,Gill RT.Iterative genome editing of Escherichia coli for 3
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hydroxypropionic acid production.Metabolic Engineering 2018；47:303
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313.)在大肠杆菌中构建了高通量CRISPR基因组编辑技术iCREATE，此方法可以短时间内“设计
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构建
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测试”含104‑
106理性设计的突变文库，但是高通量基因编辑效率在不同文库中的效率为10
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50％。
[0005]为提高CRISPR基因编辑效率，国内外研究人员通过挖掘新型CRISPR基因编辑系统、优化基因编辑酶的结构及表达、优化gRNA及供体DNA的设计及结构等方面开展工作，然而并没有一种方法或策略可以保证针对不同基因及位点进行高效的基因编辑。而针对高通量基因编辑时，设计与构建高通量CRISPR基因组编辑技术需要从DNA高通量合成与文库构建、高通量基因组编辑、文库筛选以及基因型
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表型追踪等多方面开展工作，基因编辑单元的设计需要多方面考虑，因而高通量基因编辑的编辑效率很难提升。因此，开发一种提高细菌CRISPR/Cas基因编辑效率的方法，在基因编辑过程中去除未改造的细胞，使存活的细胞皆为完成基因改造的细胞，提高使用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a的基因编辑效率，这样不仅可以提高单个靶向位点的基因突变、基因敲除、大片段DNA插入及重组效率的效率，也可以提高高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高CRISPR/Cas基因编辑效率的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)将pCas质粒及pTox质粒转入宿主菌中，所述的pCas质粒中插入有Cas基因和lambda Red系统基因，所述的pTox质粒中插入有毒性基因；(2)再将pgRNA质粒与外源DNA转入步骤(1)得到的宿主菌中，pgRNA质粒中插入有靶向目标基因gRNA_1和靶向pTox质粒的抗性基因的gRNA_2，gRNA_2的前端插入有SOS响应基因启动子，SOS响应基因启动子由pCas质粒表达的Cas蛋白与pgRNA质粒转录的gRNA_1组合后对目标靶向位点进行DNA剪切来启动；(3)pCas质粒表达的Cas蛋白与pgRNA质粒转录的gRNA_1组合对目标靶向位点进行DNA剪切，pCas质粒表达的lambda Red系统结合外源DNA实现基因重组，在培养过程中去除未经基因编辑的宿主菌，保留经基因编辑的宿主菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的宿主菌包括大肠杆菌。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中转入的方法包括电穿孔转化法和化学转化法。4.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘嵘明，梁丽亚，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：