一种用于无缝克隆的质粒及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种用于无缝克隆的质粒及其构建方法与应用。本发明专利技术质粒是以pACCRT

【技术实现步骤摘要】
一种用于无缝克隆的质粒及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物基因工程
，具体涉及一种用于无缝克隆的质粒及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]基因克隆技术，又名重组DNA技术，是指将目的基因片段插入到特定的质粒中形成重组质粒，进而实现目的基因的扩增、转录或翻译的一种基本分子生物学实验技术。
[0003]传统基因克隆技术步骤包括：选择目的片段并设计正反引物，使用引物扩增目的基因片段得到带有互补粘性末端或平末端的PCR片段，选择合适(抗性标记、酶切位点等)的克隆载体，通过连接酶将PCR片段连接入克隆载体中重组成一个新的环状质粒，将质粒转化至大肠杆菌中便可以实现目的片段的克隆。在传统的基因克隆技术中，限制性内切酶消化和连接是分步进行的，导致耗时较长，并且使用不同限制性内切酶时还需要考虑到不同酶所需的缓冲液及反应温度均有所不同，则需要经过几步亚克隆过程才能获得最终所需的重组质粒，整个过程不仅繁琐还耗时。因此无缝克隆技术越来越受人们关注，Golden Gate克隆是现在较为常见的方法之一。
[0004]Golden Gate克隆的原理是在设计目的片段引物时，在目的片段的两端添加ⅡS型限制性内切酶识别位点，利用同一种限制性内切酶产生不同的粘性末端，从而实现目的片段的克隆。该方法的载体质粒不需要提前进行线性化处理，且可以在同一体系中进行限制性内切酶消化及连接，有效地提高片段连接的准确性。
[0005]目前现有的用于克隆的质粒载体较多，但仍存在一些缺点，较为普遍的便是少量连接酶将载体和载体被酶切的小片段错连及少连等，从而导致克隆效率不高，在克隆过程中会存在较多假阳性的出现，这对后期的阳性菌落筛选造成许多不便。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术的首要目的在于提供一种用于无缝克隆的质粒。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供上述用于无缝克隆的质粒的构建方法。
[0008]本专利技术的再一目的在于提供上述用于无缝克隆的质粒的应用。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]一种用于无缝克隆的质粒，是通过将CrtE、CrtI、CrtB序列依次克隆到常规质粒中得到， CrtE、CrtI、CrtB序列两端含有相同的ⅡS型限制性酶位点；其中，CrtE序列如SEQ ID NO.1 第3124位～第4032位碱基所示，CrtI序列如SEQ ID NO.1第4217位～第5695位碱基所示， CrtB序列如SEQ ID NO.1第5691位～第6621位碱基所示。
[0011]进一步地，所述的ⅡS型限制性酶为BsaI、BsmBI或BbsI。
[0012]进一步地，所述的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]上述用于无缝克隆的质粒的构建方法，可以是按照SEQ ID NO.1所示序列进行人
工合成，也可以是以pACCRT
‑
EIB质粒为模板，通过分别设计引物进行扩增得到4个片段，再将4个片段按转录方向依次连接起来；其中：
[0014]用于扩增片段1的引物如下：
[0015]pDTK001 Part1
‑
F：5
’‑
AAGCGGTCTCCTGAcACGTTGATCGGCACGTA
‑3’
[0016]pDTK001 Part1
‑
R：5
’‑
AAGCGGTCTCCAcACGAAAAACATATTCTCAATAAACC
‑3’
[0017]用于扩增片段2的引物如下：
[0018]pDTK001 Part2
‑
F：5
’‑
AAGCGGTCTCGGTgTCAGCCAATCCCTGGGTGA
‑3’
[0019]pDTK001 Part2
‑
R：5
’‑
AAGCGGTCTCGtcgccgaGCGTGCTGCTAGCGCTATA
‑3’
[0020]用于扩增片段3的引物如下：
[0021]pDTK001 Part3
‑
F：5
’‑
AAGCGGTCTCGgcgagacgCATAGTGACTGGCGATGCT
‑3’
[0022]pDTK001 Part3
‑
R：5
’‑
AAGCGGTCTCGcagagacgTGTAGGCATAGGCTTGGTTATG
‑3’
[0023]用于扩增片段4的引物如下：
[0024]pDTK001 Part4
‑
F：5
’‑
AAGCGGTCTCGtctgaccGCATCCAGGGTGACGGTG
‑3’
[0025]pDTK001 Part4
‑
R：5
’‑
AAGCGGTCTCGgTCATTTTCGCCAAAAGTTGGC
‑3’
。
[0026]上述用于无缝克隆的质粒在无缝克隆中的应用。
[0027]进一步地，所述的应用包括如下步骤：
[0028](1)目的DNA分子PCR引物设计：用于Golden Gate反应的目的DNA分子PCR引物设计原则如下：
[0029]正向引物：5
’‑
保护碱基
‑Ⅱ
S型限制性酶识别序列
‑
任意碱基
‑
切割位点
‑
插入片段正向特异引物序列F
‑3’
；
[0030]反向引物：5
’‑
保护碱基
‑Ⅱ
S型限制性酶识别序列
‑
任意碱基
‑
切割位点
‑
插入片段反向特异引物序列R
‑3’
；
[0031](2)使用目的DNA分子PCR引物对目的基因进行PCR扩增，对获得的PCR产物进行分离回收；
[0032](3)将经过纯化回收的PCR产物与所述的用于无缝克隆的质粒、ⅡS型限制酶、T4 DNA 连接酶混合，进行Golden Gate反应；
[0033](4)反应结束后，转化普通感受态细胞；使用氯霉素抗性进行筛选后，选择白菌落进行 PCR鉴定并测序，获得目标重组质粒。
[0034]进一步地，所述的DNA分子PCR引物设计原则中，保护碱基的碱基数目为4
‑
8个，进一步优选为4
‑
6个。
[0035]进一步地，所述的DNA分子PCR引物设计原则中，切割位点可以是任意序列；优选的，切割位点的碱基数目为3
‑
8个；进一步优选为4
‑
6个。
[0036]进一步地，所述的Golden Gate反应的10μL体系如下：
[0037][003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于无缝克隆的质粒，其特征在于：是通过将CrtE、CrtI、CrtB序列依次克隆到常规质粒中得到，CrtE、CrtI、CrtB序列两端含有相同的ⅡS型限制性酶位点；其中，CrtE序列如SEQ ID NO.1第3124位～第4032位碱基所示，CrtI序列如SEQ ID NO.1第4217位～第5695位碱基所示，CrtB序列如SEQ ID NO.1第5691位～第6621位碱基所示。2.根据权利要求1所述的用于无缝克隆的质粒，其特征在于：所述的ⅡS型限制性酶为BsaI、BsmBI或BbsI。3.根据权利要求1或2所述的用于无缝克隆的质粒，其特征在于：所述的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.权利要求1
‑
3任一项中所述的用于无缝克隆的质粒的构建方法，其特征在于：按照SEQ ID NO.1所示序列进行人工合成，或以pACCRT
‑
EIB质粒为模板，通过分别设计引物进行扩增得到4个片段，再将4个片段按转录方向依次连接起来；其中：用于扩增片段1的引物如下：pDTK001 Part1
‑
F：5
’‑
AAGCGGTCTCCTGAcACGTTGATCGGCACGTA
‑3’
pDTK001 Part1
‑
R：5
’‑
AAGCGGTCTCCAcACGAAAAACATATTCTCAATAAACC
‑3’
用于扩增片段2的引物如下：pDTK001 Part2
‑
F：5
’‑
AAGCGGTCTCGGTgTCAGCCAATCCCTGGGTGA
‑3’
pDTK001 Part2
‑
R：5
’‑
AAGCGGTCTCGtcgccgaGCGTGCTGCTAGCGCTATA
‑3’
用于扩增片段3的引物如下：pDTK001 Part3
‑
F：5
’‑
AAGCGGTCTCGgcgagacgCATAGTGACTGGCGATGCT
‑3’
pDTK001 Part3
‑
R：5
’‑
AAGCGGTCTCGcagagacgTGTAGGCATAGGCTTGGTTATG
‑3’
用于扩增片段4的引物如下：p...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜建国，谢珊蓉，陈浩宏，梁明华，戴聚良，吴婧璇，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：