一种智能工程细菌系统及其制备和在抗肿瘤药物中的应用技术方案

本发明专利技术提供了一种智能工程细菌系统及其制备和在抗肿瘤药物中的应用，所述智能工程细菌系统为装载有质粒的细菌，所述细菌对肿瘤组织具有趋向作用，所述质粒包含编码融合蛋白的基因片段，所述融合蛋白由所述细菌分泌表达，所述融合蛋白包含蛋白A、抗肿瘤肽以及连接二者且能被基质金属酶

【技术实现步骤摘要】
一种智能工程细菌系统及其制备和在抗肿瘤药物中的应用


[0001]本专利技术属于纳米生物医药
，具体涉及一种智能工程细菌系统及其制备方法和在抗肿瘤药物中的应用。

技术介绍

[0002]肿瘤一直是威胁人类生命健康的重大疾病。目前，针对肿瘤的治疗方法如手术治疗、放疗、化疗以及近些年兴起的免疫治疗、基因治疗、细胞疗法等，都能在一定程度上缓解肿瘤症状，但不可避免的存在一些各自弊端。其中负载药物的非靶向富集和释放是实现安全高效治疗的主要障碍。随着精准医疗概念的提出，利用多功能载体进行肿瘤靶向治疗得到大量研究与快速发展，展现出临床应用的潜能。
[0003]近年来，基于细菌的肿瘤治疗研究呈指数增长，也取得阶段性成果，表现出巨大的临床推广意义。因肿瘤组织存在的细胞因子和乏氧微环境，兼性厌氧菌和厌氧细菌有向肿瘤部位迁移的趋势；同时，肿瘤组织免疫抑制微环境也为细菌的定殖提供了便利条件。相比于传统肿瘤治疗方法，新概念细菌疗法是一种新型的、具有靶向性的高效肿瘤治疗方法，有效的避免了传统疗法中存在的前期不敏感和后期耐药性等问题。随着合成生物学的蓬勃发展，科研人员积极探索如何进一步优化肿瘤细菌疗法，为肿瘤治疗提供更多样化的策略。细菌基因组简单，易于进行工程改造。利用基因工程技术重塑细菌的合成基因网络，甚至将整个化学合成基因组移植到细菌内，是一种前瞻性的靶向肿瘤治疗方法。表达抗肿瘤蛋白的肿瘤靶向细菌可以降低对宿主的致病性和毒副作用，优化治疗方案。
[0004]作为非己异源物，基于细菌的肿瘤疗法其体内生物安全性一直是大家所关心的焦点问题。细菌的致病性以及细菌壁脂多糖成分引起的机体强烈炎症反应，都是细菌疗法过程中存在的问题。目前，针对这些问题普遍采用的应对策略是选用非致病性细菌或对菌株减毒处理。但治疗结束后肿瘤组织内部的细菌残留及去向仍然成迷，其对机体造成的潜在安全隐患不容忽视。此外，利用基因重组技术使细菌表达抗肿瘤蛋白，在此过程中抗肿瘤蛋白的精准合成与释放以及是否会损伤正常组织也是我们设计过程中需要考虑的细节。

技术实现思路

[0005]针对现有肿瘤细菌疗法的不足，本专利技术旨在构建一种智能工程细菌系统，其克服了传统肿瘤治疗过程中出现的药物非靶向富集、药物疗效不佳以及体内给药系统安全性问题，具有显著的抗肿瘤效果和高安全性。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]一种智能工程细菌系统，具体为装载有质粒的细菌，该细菌对肿瘤组织具有趋向作用，质粒包含编码融合蛋白的基因片段且该融合蛋白由上述细菌分泌表达，上述融合蛋白包含蛋白A、抗肿瘤肽以及连接二者且能被基质金属酶
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2靶向切割的基质金属酶
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2敏感肽，其中蛋白A具有失活抗肿瘤肽功能的作用。
[0008]在上述方案中，细菌作为载体，智能工程细菌系统的肿瘤靶向性是通过载体细菌
对肿瘤组织的趋向作用实现的，而且载体细菌利用肿瘤组织的免疫抑制微环境能够定殖于肿瘤组织中，故载体细菌应为兼性厌氧菌或厌氧细菌，如大肠杆菌。
[0009]在上述方案中，智能工程细菌系统中的融合蛋白完全由载体细菌分泌表达，融合蛋白中的蛋白A可失活抗肿瘤肽的功能，使得该系统在非肿瘤组织中无明显细胞毒性；而当该系统到达肿瘤部位时，基质金属酶
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2敏感肽被肿瘤部位高表达的基质金属酶
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2(MMP
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2)切断，进而蛋白A对抗肿瘤肽的功能抑制作用被解除，抗肿瘤肽发挥抗肿瘤效果，杀死肿瘤细胞。因此，该智能工程细菌系统实现了抗肿瘤肽的靶向递送和精准释放，提高杀死肿瘤细胞的效果。
[0010]在本专利技术的一个具体实施例中，融合蛋白具体包含超折叠绿色荧光蛋白GFP和蜂毒素(Melittin，氨基酸序列为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ)，GFP通过基质金属酶
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2敏感肽偶联于Melittin的N端。融合蛋白N端GFP作为非信号肽引导目的蛋白分泌，可以显著降低Melittin的细胞毒性，并且可以提高融合蛋白可溶性。同时GFP会附着在细胞膜上屏蔽细菌自身内毒素的毒性，降低细菌毒素给机体带来的炎症反应。当基质金属酶
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2敏感肽被切断后，GFP对Melittin的功能抑制作用被解除，Melittin发挥抗肿瘤作用。而且Melittin也是抗菌肽并具有显著的抗炎效果，其被释放后还可以致死细菌并引起免疫原性肿瘤细胞死亡，加强抗肿瘤效果。因此，表达该融合蛋白的智能工程细菌系统不仅能实现蜂毒素的靶向递送和精准释放，还能清除细菌自身，实现体内肿瘤高效安全治疗。
[0011]进一步地，在上述实施例中，当基质金属酶
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2敏感肽的氨基酸序列为PLGVR，且融合蛋白的N端修饰有6*His标签时，该融合蛋白(记为GPM)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]本专利技术进一步提供了构建分泌表达序列如SEQ ID NO.1所示融合蛋白的智能工程细菌系统的方法，具体为：
[0013]步骤1、利用PCR技术扩增目的基因片段和线性化载体，其中目的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，线性化载体为含有6*His
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GFP的载体，且目的基因片段与线性化载体有同源区域；
[0014]步骤2、利用T5外切酶切割线性化载体和目的基因片段的5'端同源臂，连接成环状质粒，热激转化至大肠杆菌，利用细菌体内连接酶补齐缺口，再对重组子进行筛选和鉴定；
[0015]步骤3、将重组质粒转化至受体菌后进行诱导表达。
[0016]在上述构建方法中，目的基因片段的合成方法为：以序列如SEQ ID NO.9～10所示的引物互为模板，退火后互补配对成DNA双链，再以该双链为模板，在序列如SEQ ID NO.11～12所示引物对的引导下合成。
[0017]作为优选地，步骤3中的受体菌为大肠杆菌BL21(DE3)plysS且采用IPTG诱导表达。
[0018]本专利技术提供的智能工程细菌系统可用于制备抗肿瘤药物，所得药物可用于实体瘤的治疗，且给药方式为注射给药。
[0019]本专利技术的有益效果为：
[0020](1)高效表达、智能响应：本专利技术提供的智能工程细菌系统E.coli@GPM利用大肠杆菌高效分泌表达融合蛋白GPM，且携带有基质金属酶敏感肽的GPM可在肿瘤部位环境响应性激活，使蜂毒素的抗菌、抗肿瘤活性得以恢复并在肿瘤局部精准释放。
[0021](2)抗肿瘤效果显著：智能工程细菌系统E.coli@GPM利用大肠杆菌趋向肿瘤组织
的特性，使工程菌富集于肿瘤部位后才释放并激活Melittin，能显著抑制肿瘤生长，对接种有结肠癌细胞的Babl/c小鼠肿瘤抑制率高达80％。
[0022](3)具有显著生物安全性，无毒：融合蛋白GPM相对于裸露的蜂毒素蛋白，其溶血效果显著改善；且在荷瘤小鼠注射E.coli@GP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种智能工程细菌系统，其特征在于，所述智能工程细菌系统为装载有质粒的细菌，所述细菌对肿瘤组织具有趋向作用，所述质粒包含编码融合蛋白的基因片段，所述融合蛋白由所述细菌分泌表达，所述融合蛋白包含蛋白A、抗肿瘤肽以及连接二者且能被基质金属酶
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2靶向切割的基质金属酶
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2敏感肽，所述蛋白A能失活所述抗肿瘤肽。2.根据权利要求1所述的智能工程细菌系统，其特征在于，所述蛋白A为超折叠绿色荧光蛋白GFP，所述抗肿瘤肽为蜂毒素，所述GFP通过基质金属酶
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2敏感肽偶联于蜂毒素的N端。3.根据权利要求2所述的智能工程细菌系统，其特征在于，所述基质金属酶
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2敏感肽的氨基酸序列为PLGVR。4.根据权利要求3所述的智能工程细菌系统，其特征在于，所述融合蛋白的N端修饰有6*His标签，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且编码该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.根据权利要求1所述的智能工程细菌系统，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌。6.一种构建如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张成，马立新，许文轩，任德宝，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：