设计用于治疗性疫苗的重组痘病毒的方法技术

本发明专利技术一般性涉及一种设计用于治疗性疫苗即个性化癌症疫苗的重组痘病毒的方法，所述重组痘病毒包含一或多个表达盒，每个表达盒用于表达多个肽即新肽的融合物，其特征在于，它包括通过服务器(1)的处理装置(11)执行以下步骤：(a)选择第一子集的候选肽，其中所述肽呈现低于TMS阈值的跨膜分值；(b)在多个可能分布中确定所述第一子集的候选肽到表达盒的最佳分布，其中如果有至少两个表达盒，所述最佳分布呈现在至少两个表达盒的亲水性分值之间的最低范围；(c)对于每个表达盒，根据盒插槽占用规则确定候选肽的最佳插槽分配，以选择具有最低TM分值的多肽融合物；(d)确定包含所述一或多个表达盒的核苷酸序列的DNA转移序列，以产生所述重组痘病毒。所述重组痘病毒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】设计用于治疗性疫苗的重组痘病毒的方法
专利

[0001]本专利技术一般性涉及设计重组痘病毒的方法，该重组痘病毒包含一个或多个表达盒，每个表达盒用于表达一个或多个肽的融合物，一种制备这种重组痘病毒的方法，以及这种重组痘病毒及其用于治疗或预防疾病、特别是用于治疗或预防癌症的用途。

技术介绍

[0002]在过去几十年里，许多表达抗原的治疗性疫苗已经产生，目的是刺激针对这些抗原的先天和特异性免疫反应。例如，许多最早的癌症疫苗是引发针对最常见的在肿瘤中过表达的肿瘤相关抗原(TAA)(如MUC
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1、WT1、PSA、CEA)的免疫反应。然而，这些TAA在非肿瘤细胞中可能有残留表达；因此，这种传统方法的疗效预计会受到对这种"自身"抗原的自身耐受性的限制。其他研究小组也专注于使用多表位多肽来改善其候选疫苗的疗效并诱导针对各种疾病相关抗原的广泛特异性T细胞反应(例如Depla等，2008，J.Virol.82(1):435
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450)。鉴别CTL表位、合成编码多个含多表位多肽的基因以及通过DNA质粒和病毒载体进行递送的技术现在已经非常适用。
[0003]此外，向群体中的每一个递送同一组癌症抗原的传统范式忽视了疾病风险和免疫反应的个体差异性。重要的是，不能忽视的是，人类对疫苗的反应不同，宿主的免疫反应在群体中变化限制(Relman,2008,J Infect Dis.198(1):4
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5；Plotkin,2008,Clin Infect Dis.47(3):401
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9)。随着最近免疫检查点阻断剂在临床上的引入，医务人员确实已经清楚地认识到，有些治疗对一些患者有效，但对另一些则无效。
[0004]免疫学、遗传学、分子生物学和生物信息学方面的进展为更个性化的方法铺平了道路。基因组测序领域的技术突破(如下一代测序(NGS))现在已经可以以前所未有的速度和成本对肿瘤的整个基因组或外显子组(基因组的编码区)进行测序。肿瘤的分子特征表明，在癌变和癌细胞增殖的过程中，由于高增殖率、缺陷的修复机制和克隆选择而发生突变。肿瘤基因组中突变的累积通常会导致异常蛋白质物种的表达，而这些蛋白质是癌症组织特有的。这些被称为新抗原。与最常见的肿瘤相关抗原相比，肿瘤新抗原只存在于肿瘤细胞中，而不存在于正常细胞中，并且不诱导胸腺中其抗原特异性T细胞的缺失。因此，预计它们会诱导强烈的免疫反应，而不承担自身耐受和针对自身蛋白的自身免疫反应的风险。因此，肿瘤新抗原可能是设计专门适应于肿瘤的治疗性疫苗的理想靶，尽管将其用于常规护理需要克服一些科学和技术挑战。特别地，大多数癌症突变是随机现象的结果，对每个患者都是特定的。
[0005]在其他议题中，成功转化从属于实现有效的制造过程，以确保迅速向患者的床边递送足够数量的临床药物，因为识别肿瘤突变、设计包含这些突变的新肽、制造和测试个性化疫苗是与疾病进展相伴随的。
[0006]因此，在申请WO2018/234506中提出了一种个性化癌症疫苗，其包含编码新肽的重组痘病毒(每个新肽包括至少一个肿瘤特异性突变)，以及制备所述个性化癌症疫苗的方法。痘病毒是双链DNA病毒，其生命周期发生在细胞质中并利用细胞机制和其自身病毒蛋白
进行复制。
[0007]更详细地，该方法包括鉴别适合由所谓的个性化癌症疫苗编码的新肽的步骤，以及产生所述重组痘病毒的步骤。为此，要插入重组痘病毒基因组中的所述肽编码核酸分子是随机排列的，但要重视一个或多个在适当调节元件的控制下允许在受试者中表达的"表达盒"(优选3个盒，每个盒编码带有至多10个肽的融合物)中融合物长度的平衡。重组痘病毒本身的产生通常是通过亲本痘病毒和"转移"质粒之间的同源重组进行的，其包含肽表达盒以及额外特征如侧翼重组臂和表达盒克隆所需的酶限制位。通过使用编码选择或彩色标记的报告基因，以反映表达盒在痘病毒基因组中的插入情况，可以促进对整合了肽表达盒的重组痘病毒的选择，尽管需要更精细的分析(如PCR)来确认重组状态。
[0008]然而，人们怀疑疏水性肽和带有跨膜(TM)结构域的肽的表达可能会损害重组病毒的产生或生产，因此使一些候选疫苗的开发失效。当TM结构域在一个给定肽内时(肽内TM)，所述肽可能被简单地放弃，但也观察到，TM结构域可能由表达盒编码的融合物内的两个特定肽(肽间TM)的连接而产生，这需要修改肽的顺序。痘病毒的另一个特点是它们对同源重组事件的敏感性。在控制下，它是遗传工程的一个优势，但当意外的同源区被掺入时，其仍然是一个问题。
[0009]处理这个问题的一个简单方法是简单地去除TM和具有高疏水性指数的肽，但这不是很有效，如WO2018/234506的实施例5所说明的。这个实施例显示了设计用来表达一组分布在三个表达盒中的30条肽的重组MVA的产生是多么棘手。抑制肽间(通过肽反转)和肽内(通过消除含TM的肽)潜在TM段，不允许产生表达重组MVA。肽融合物的疏水性评分减少也不行(从133分到28.5分)。这说明即使选择不含TM的多肽和低疏水性指数的肽时，重组痘病毒的产生或生产仍然非常低。
[0010]因此，需要一种解决方案来设计优化的表达盒，以表达多个多肽或一个或多个肽融合物。本专利技术提出了一个基于以下特性的方法：疏水性和与疏水性相关的蛋白质特征、形成跨膜结构域的倾向性和序列同源性；以及肽中一个肽相对于其它肽在融合物中的位置。正如实施例部分所表明的，本专利技术的方法允许提高重组痘病毒产生的产率。
[0011]这一技术问题通过提供权利要求书中定义的实施方案得到了解决。
[0012]本专利技术的其他和进一步的方面、特征和优点将从以下对本专利技术目前优选实施方案的描述而明显。这些实施方案为了公开目的而给出。
[0013]专利技术简述
[0014]根据第一方面，本专利技术涉及一种设计重组痘病毒的方法，所述重组痘病毒包含一个或多个表达盒，每个表达盒用于表达一个或多个肽的融合物，其特征在于，它包括通过服务器的处理装置执行以下步骤：
[0015](a)选择第一子集的候选肽，其中所述肽呈现低于TMS阈值的跨膜分值；
[0016](b)在多个可能分布中确定所述第一子集的候选肽到表达盒的最佳分布，其中如果有至少两个表达盒，所述最佳分布呈现在至少两个表达盒的亲水性分值之间的最低范围；
[0017](c)对于每个表达盒，根据盒插槽占用规则确定候选肽的最佳插槽分配，并选择具有最低TM分值的肽融合物；
[0018](d)确定包含所述一个或多个表达盒的核苷酸序列的DNA转移序列，以产生所述重
组痘病毒。
[0019]根据有利的和非限制性的特征：
[0020]步骤(a)的所述肽呈现低于同源性阈值的连续区域。
[0021]步骤(a)包括，如果肽呈现超过TMS阈值的跨膜分值和/或根据预测的免疫原性潜力具有超过同源性阈值的排名较高的候选肽的同源性区域，则舍弃这些肽，并从鉴定的候选肽集合中选择第二子集作为候选肽，其既未公开也未在第一子集中选择。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种设计重组痘病毒的方法，所述重组痘病毒包含一个或多个表达盒，每个表达盒用于表达一个或多个肽的融合物，其特征在于，它包含通过服务器(1)的处理装置(11)执行以下步骤。(a)选择第一子集的候选肽，其中所述肽呈现低于TMS阈值的跨膜分值；(b)在多个可能分布中确定所述第一子集的候选肽到所述表达盒的最佳分布，其中如果有至少两个表达盒，所述最佳分布呈现在至少两个表达盒的亲水性分值之间的最低范围；(c)对于每个表达盒，根据盒插槽占用规则确定所述候选肽的最佳插槽分配，以选择具有最低TM分值的肽融合物；(d)确定包含所述一个或多个表达盒的核苷酸序列的DNA转移序列，以产生所述重组痘病毒。2.权利要求1的方法，其中步骤(a)的所述肽呈现低于同源性阈值的连续区域。3.权利要求2的方法，其中步骤(a)包括，如果肽呈现高于TMS阈值的跨膜分值和/或根据预测的免疫原性潜力具有高于同源性阈值的排名较高的候选物的同源区域，则放弃这些肽，并选择所鉴定的候选肽集合的第二子集作为候选肽，其既未公开也未在第一子集中选择。4.权利要求1至3任一项的方法，其中步骤(b)包括，如果可能分布的数量超过服务器(1)的处理装置(11)的资源的给定最大数量函数，则尝试在所述多个可能分布中的所述最大数量的可能分布的至少一个迭代中确定所述第一子集的候选肽到所述表达盒的最佳分布。5.权利要求4的方法，其中步骤(b)包括，如果对于所述最大数量的可能分布的迭代的每个可能分布，至少一个表达盒呈现高于给定阈值的亲水性分值，则考虑所述最大数量的可能分布的另一迭代；或者用第二子集的候选肽替换呈现最高亲水性分值的第一子集的候选肽，并再次进行步骤(a)的肽选...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：特兰斯吉恩股份有限公司，
类型：发明
国别省市：