副痘病毒属载体制造技术

本发明专利技术属于病毒免疫疗法领域。本发明专利技术提供新型的假牛痘(PCPV)病毒，尤其是重组的PCPV，其组合物以及它们用于预防或治疗疾病尤其是增生性疾病比如癌症和再狭窄以及感染性疾病例如慢性感染性疾病的治疗用途。本发明专利技术还提供生成和扩增这种PCPV的方法以及用这种PCPV来引发或刺激和/或重定向免疫应答的方法。更具体地，本发明专利技术提供一种现有痘病毒属载体诸如MVA(修饰的安卡拉病毒)的替换方案，并且可以很大程度上用于治疗性疫苗接种。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】副痘病毒属载体
本专利技术属于病毒免疫疗法领域。本专利技术提供新型的假牛痘(PCPV)病毒，尤其是重组的PCPV，其组合物以及它们用于预防或治疗疾病尤其是增生性疾病比如癌症和再狭窄以及感染性疾病的治疗用途。本专利技术还提供用于生成和扩增这种PCPV的方法以及用这种PCPV来引发或刺激和/或重定向(re-orienting)免疫应答的方法。更具体地，本专利技术提供一种现有痘病毒属载体诸如MVA(修饰的安卡拉病毒)的替换方案，并且可以很大程度上用于治疗性疫苗接种。
技术介绍
免疫疗法致力于增强宿主的免疫系统，以帮助机体根除病原体和异常细胞。免疫疗法广泛应用于传统的疫苗接种，也正在积极研究免疫疗法作为治疗严重、慢性或威胁生命的疾病的一种潜在方式，以期刺激特异性和先天性免疫应答。几十年来，文献中已经描述了大量的免疫疗法。特别是，现在已经出现了数种病毒和非病毒载体，它们都有相对的优势和局限性，使它们更适合某些适应症(参见例如CattaneoandRussell,2017,PLOSPathogensdoi:10.1371/journalppat.1006190；Kaufmanetal.,2015,NatureReviewsDrugDiscovery14:642-661；Gomezetal.,2013expertRevVaccines12(12):1395-1416)。大量的免疫治疗平台正在临床试验中被评估，目前基于痘病毒疗法(无论是否溶瘤)的临床研究的数量，都反映了它们有吸引力的治疗潜力。例如，基于重组痘苗病毒(VV)的载体因其优越的安全性和将强大的细胞抗原特异性免疫应答与对固有免疫系统的普遍刺激相结合的能力而成为引入注目的候选物。TG4010(或其研究名称为MVATG9931)是一种治疗性癌症疫苗，其基于编码MUC1肿瘤相关抗原和人类白细胞介素2(IL-2)的修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)。TG4010与晚期转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的一线护理化疗标准相结合，在两个不同的随机对照2b期临床试验中证明有疗效(Quoixetal.,2011,TheLancetOncology12(12):1125-33)。副痘病毒代表着可用于载体疫苗的不同候选物。副痘病毒属(Parapoxviruses)属于痘病毒科(familyPoxviridae)和脊椎动物痘病毒亚科(subfamilyChordopoxvirinae)。副痘病毒通常被认为是反刍动物皮肤病的病原体，导致丘疹状口炎和接触性脓疱性皮炎，尤其是在嘴唇、鼻孔、口腔黏膜和乳头区域。与痘病毒科的其他成员一样，副痘病毒是相对大的包膜双链DNA病毒，几何形呈卵圆，可感染脊椎动物，包括可供选择的多种哺乳动物和人类。副痘病毒有独特的螺旋状外壳，使其与其他痘病毒区别开来。与痘病毒一样，副痘病毒的复制在细胞质内。病毒蛋白与宿主糖胺聚糖(GAG)结合介导病毒进入宿主细胞的内吞作用，从而得以进入宿主细胞。与细胞膜融合使核心物质(core)释放到宿主细胞质中。借助病毒RNA聚合酶在细胞质中转录早期基因。早期表达在感染后30分钟开始。在感染后大约100分钟，中期触发基因组DNA复制。然后晚期基因在感染后140分钟至48小时表达，产生所有结构蛋白。子代病毒粒体的组装开始于细胞质病毒工厂，产生球形的未成熟颗粒。病毒颗粒成熟为砖状细胞内成熟病毒粒体(IMV)。IMV病毒粒体可在细胞裂解时释放，也可从反式高尔基体(trans-Golgi)和芽中获得第二个双膜，作为外部有包膜的病毒粒体(EEV)宿主受体，介导细胞内吞作用。这种病毒在细胞死亡后通过存在于包含体(occlusionbody)中离开宿主细胞，并在找到另一个宿主之前保持感染性。复制活性的(Replication-competent)和灭活的副痘病毒以其免疫调节特性而闻名(Schulzeetal.,2009,VetMicrobiol.137:260-7)。绵羊副痘病毒(ORFV)是副痘病毒属的原型种，已成功地应用于兽医，以提高动物慢性持续性病毒感染的一般抵抗力(参见例如US6,365,393；WO97/32029以及US2003-0013076)以及用于治疗HIV的人类药物(WO2006/005529)，并被一些人认为是溶瘤的(Rintouletal.,2012,Mol.Ther.20(6):1148-57)。在ORFV基因组中鉴定了不同的插入位点(WO97/37031)。值得注意的是，编码犬瘟热病毒(CDV)抗原的重组ORFV在猪中被用作抗CDV的疫苗(WO2012/01145)和抗假性狂犬病病毒的疫苗(Rooijetal.,2010,Vaccine28(7):1808-13)。原名是从株D1701衍生的化学灭活ORFV的制剂，用于预防性和治疗性治疗感染性疾病，以及用于预防动物应激性疾病。灭活的ORFV可能通过TLR-9依赖性途径的衔接(engagement)诱导浆细胞样树突状细胞(pDC)(VonButtlaretal.,2014,PLOSOne9(8):e106188)。最近，Choi等人(2017,Surgery,doi10.1016/j.surg.2017.09.030)报告了一种嵌合副痘病毒在三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤中具有强大的细胞毒性活性。嵌合ORF病毒注射后1周在肿瘤组织中检测到嵌合ORF病毒活跃的复制，在病毒处理的肿瘤组织周围观察到自然杀伤(NK)细胞浸润。显然很有必要开发有效的方法来治疗威胁生命的疾病如癌症和感染性疾病。事实上，病变细胞已经进化出强大的免疫抑制机制来逃避免疫系统，造成有效免疫疗法的主要障碍。因此，触发先天性和特异性免疫机制可能是成功开发更有效的免疫疗法的关键。本专利技术涉及使用副痘病毒属作为用于递送治疗基因的载体。本专利技术人惊奇地发现，鉴于其有限的致病性和免疫调节特性，假牛痘病毒(PCPV)提供了显著的优势，使得它特别适合于抗癌治疗。本专利技术人发现，PCPV提供了一种与其他痘病毒不同的强大的先天免疫特性，这表现在它活化许多细胞因子和趋化因子的分泌的能力，这些细胞因子和趋化因子刺激免疫效应细胞的水平高于传统的MVA和VV。副痘病毒属的另一个成员，牛丘疹状口炎病毒(bovinepapularstomatitisvirus，BPSV)在PBMC中表现出与PCPV相似的作用，其上清液中分泌的IFN-α显著增加。此外，在体外衍生的人M2型巨噬细胞中CD86表达的增加，表明PCPV在M2巨噬细胞向抑制性较低的表型重编程中起作用。最后，在同基因动物模型中，工程化成表达肿瘤相关抗原(TAA)的重组PCPV病毒对控制肿瘤生长和提高存活特别有效。PCPV联合抗PD1抗体在“双瘤”模型中表现出统计学显著的肿瘤控制改善。由于PCPV和BPSV病毒所表现出的免疫原性特性的改善，本领域技术人员可以期望副痘病毒可成功地作为其他病毒疗法的替代品用于治疗或预防增生性疾病如癌症和感染性疾病(例如，慢性HBV)。因此，PCPV或BPSV是治疗性疫苗的候选物，它可以对肿瘤环境产生影响。
技术实现思路
本专利技术的一方面涉及假牛痘病毒(PCPV)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种假牛痘病毒(PCPV)，其中所述PCPV包含插入在其基因组中的至少一种外来核酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180307 EP 18305237.2;20181031 EP 18306424.51.一种假牛痘病毒(PCPV)，其中所述PCPV包含插入在其基因组中的至少一种外来核酸。


2.如权利要求1所述的PCPV，其中所述PCPV得自由ATCC编号ATCCVR-634TM确认的野生型TJS株或者得自具有相同或相似名称的病毒株或其功能片段和变体。


3.如权利要求1或2所述的PCPV，其中所述PCPV进一步对于PCPV基因组编码的病毒功能是缺损的，优选对于非必需病毒功能是缺损的，更优选对于所述外来核酸的插入位点处编码的病毒基因功能是缺损的。


4.如权利要求1至3中任一项所述的PCPV，其中所述外来核酸编码选自以下的多肽：补偿对象中缺损或缺陷蛋白质的多肽，通过毒性作用限制或从机体清除病变细胞的多肽，诸如自杀基因产物；能够增强抗肿瘤功效的多肽，诸如武装基因产物；以及能诱导或活化免疫应答的多肽，诸如免疫刺激性和抗原性多肽。


5.如权利要求4所述的PCPV，其中所述免疫刺激性多肽选自：细胞因子诸如白细胞介素、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子，APC外露蛋白，具有抗血管生成作用的多肽，和影响细胞表面受体调节的多肽诸如免疫检查点的激动剂或拮抗剂。


6.如权利要求5所述的PCPV，其中所述免疫刺激性多肽是白细胞介素或集落刺激因子，特别是GM-CSF，或者是激动剂OX40-针对性抗体。


7.如权利要求4所述的PCPV，其中所述抗原性多肽是癌症抗原诸如MUC-1抗原，病毒抗原性多肽诸如HPV-16E7抗原或HBV抗原。


8.如权利要求1至7中任一项所述的PCPV，其中所述至少一种外来核酸可操作地连接合适的用于在期望的宿主细胞或对象中表达的调节元件。


9.如权利要求4所述的PCPV，其中所述至少一种外来核酸置于痘病毒属启动子、优选痘苗病毒启动子且更优选选自以下的启动子、合成的启动子以及早期/晚期嵌合启动子的控制下：7.5K、H5R、11K7.5、SE、TK、pB2R、p28、p11和K1L启动子。


10.如权利要求1至9中任一项所述的PCPV，其中所述至少一种外来核酸插入在VEGF基因座中。


11.一种通过在包含外来核酸的转移质粒与PCPV基因组之间的同源重组生成权利要求1至10中任一项所述的PCPV的方法，所述外来核酸的5’和3’侧翼有分别存在于插入位点上游和下游的PCPV序列，其中所述方法包含生成所述转移质粒的步骤和将所述转移质粒引入到合适的宿主细胞的步骤，尤其是与包含存在于转移质粒中的侧翼序列的PCPV病毒一起引入。


12.如权利要求11所述的方法，其中所述至少一种外来核酸在PCPV基因组中的插入位点是在病毒基因中、在基因间隔区中、在PCPV基因组不编码基因产物的部分中或者在重复基因座中，所述病毒基因优选非必需病毒基因。


13.如权利要求12所述的方法，其中将所述外来核酸插入所述PCPV基因组之后，插入位点处的病毒基因座至少部分地缺失，产生所述病毒功能的缺损PCPV病毒。


14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述至少一种外来核酸插入到VEGF基因座中。


15.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述转移质粒进一步包含一种或多种选择和/或可检测的基因，以便于鉴定重组PCPV。


16.如权利要求15所述的方法，其中在能够在所述选择或可检测的基因中提供双链断裂的内切核酸酶的存在下将所述转移质粒引入宿主细胞。


17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述选择基因是编码允许在选择性培养基中生长的鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的GPT基因，和/或所述可检测的基因编码GFP、e-GFP或mCherry。


18.如权利要求11至17中任一项所述的方法，其中所述合适的宿主细胞是牛鼻甲骨(BT)细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·里特纳，C·雷米，C·蒂欧德勒特，
申请(专利权)人：特兰斯吉恩股份有限公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR