一种高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用。构建方法以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，在基因组编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因位置和编码二氢嘧啶二羧酸合成酶dapA基因位置整合了由乳糖启动子Ptac控制的T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP，同时引入可诱导表达的T7RNA聚合酶基因；在基因组编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的基因位置整合了由T7强启动子控制来源于谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸激酶lysC基因；导入重组载体pXMJ19

【技术实现步骤摘要】
一种高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]四氢嘧啶是一种环状氨基酸衍生物，首次从极端嗜盐外硫红螺菌属的光合紫细菌中发现，后续发现在嗜盐或耐盐微生物中普遍存在，具有很强的水分子络合能力，在高渗透压、高温、低温、干燥、强酸碱和辐射等逆境条件下对蛋白质、核酸、酶、生物膜及细胞都有很好的保护作用，目前在医药、化妆品和生物制剂等领域应用广泛，前景广阔。
[0003]四氢嘧啶的合成主要有化学方法和生物方法，因生物合成方法较化学合成方法生产过程简单、合成率高、后期分离纯化难度低、对环境友好等特点，被广泛采用。早期四氢嘧啶的生物合成多通过噬盐单胞菌“细菌挤奶”方式生产，需要高盐环境且产量较低，最近几年研究者通过以大肠杆菌等模式菌株为底盘细胞构建基因工程菌株异源合成四氢嘧啶，避免了使用高盐培养基带来的一些弊端降低了发酵难度，且后期提取纯化简单，降低了四氢嘧啶的生产成本。
[0004]虽然目前报道的四氢嘧啶工程菌能在低盐条件下合成四氢嘧啶，避免了使用高盐培养基带来的一些弊端，但报道菌株多为大肠杆菌，大肠杆菌本身会产生内毒素有潜在的安全问题，而四氢嘧啶作为医药和化妆品原料安全问题至关重要；并且大肠杆菌大规模发酵经常面临噬菌体污染的问题，制约了大肠杆菌用于四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用。与大肠杆菌相比，谷氨酸棒杆菌作为另外一种成熟的工业微生物生产菌株，具有发酵稳定、不产内毒素的特点，是公认的安全菌株，虽然目前也有利用谷氨酸棒杆菌生产四氢嘧啶的报道，但产量较低，因此，开发一种高产的四氢嘧啶谷氨酸棒杆菌，提高合成效率、降低生产成本，对四氢嘧啶工业化生产和大规模应用有重要的实践意义。

技术实现思路

[0005]针对现有谷氨酸棒杆菌生产四氢嘧啶的产量偏低的技术问题，本专利技术提供一种高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用，对四氢嘧啶工业化生产和大规模应用有重要的实践意义。
[0006]第一方面，本专利技术提供一种高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，在基因组编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因位置和编码二氢嘧啶二羧酸合成酶dapA基因位置整合了由乳糖启动子Ptac控制的T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7 RNAP，减弱L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
半醛向苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸的支路代谢，同时引入可诱导表达的T7RNA聚合酶基因；在基因组编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的基因位置整合了由T7强启动子控制来源于谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸激酶lysC基因，增强天冬氨酸到4
‑
磷酸天冬氨酸的代谢，同时有助于草酰乙酸的积累；导入重组载体pXMJ19
‑
T7
‑
ectABC，构建由T7强启动子控制的L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
半醛到四氢嘧啶的合成通路。
0.5
‑
1.5g/L、消泡剂0.3
‑
0.6g/L、FeSO4·
7H2O 10
‑
80mg/L、MnSO4·
H2O 10
‑
80mg/L、生物素0.2
‑
1mg/L，其余为水，用液氨调节pH值至7.0
‑
7.2；
[0026]复合氨基酸包括均匀混合的高丝氨酸100
‑
200g、蛋氨酸100
‑
200g、苏氨酸100
‑
200g、天冬氨酸100
‑
200g；
[0027](4)发酵培养：按照10％
‑
20％接种量转移二级种子到装有发酵培养基的发酵罐中，发酵过程中控制pH值稳定在7.2左右，温度维持在30℃，溶氧在10％
‑
30％；当培养基中的初始葡萄糖消耗完之后，添加终浓度0.2
‑
1.0mm的IPTG，间隔流加50％(m/v)的葡萄糖溶液，通过调节单次补糖量和补糖频次，使溶氧在单个补糖周期内上下波动，振幅为15％
‑
30％，维持6
‑
8h；后加快补糖速率，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.5
‑
5g/L；发酵周期为32
‑
40h；
[0028]发酵培养基成分为葡萄糖20
‑
30g/L、玉米浆10
‑
20g/L、蛋白胨3
‑
7g/L、牛肉浸粉1
‑
3g/L、复合氨基酸4
‑
8g/L、柠檬酸2
‑
4g/L、(NH4)2SO
4 4
‑
6g/L、KH2PO
4 3
‑
5g/L、MgSO
4 0.5
‑
1.5g/L、消泡剂0.6
‑
1.5g/L、FeSO4·
7H2O 10
‑
80mg/L、MnSO4·
H2O 10
‑
80mg/L、生物素0.2
‑
1mg/L，其余为水，用液氨调节pH值至7.0
‑
7.2；
[0029]复合氨基酸的配方是均匀混合的高丝氨酸100
‑
200g、蛋氨酸100
‑
200g、苏氨酸100
‑
200g、天冬氨酸100
‑
200g。
[0030]进一步的，四氢嘧啶发酵量的检测方法为：用去离子水适当稀释发酵液，12000rpm离心5min后取上清用0.22μm滤膜过滤，使用高效液相色谱法测定，色谱仪为安捷伦1260Infinity II，色谱柱为ZORBAX SB
‑
C18，流动相为2％乙腈溶液，柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为10μL，紫外检测波长为210nm，保留时间为10min，并配置一系列浓度梯度的四氢嘧啶溶液作为标准样品，绘制标准曲线。
[0031]本专利技术的有益效果在于：
[0032](1)本专利技术提供的高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌，具有良好的生长性状，四氢嘧啶发酵产量高，出发菌株为谷氨酸棒杆菌模式菌株CGMCC 1.1886，遗传背景清晰，基因操作简单高效，方便对其进行进一步的基因表达修饰。
[0033](2)本专利技术使用上述高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶，避免了常规利用嗜盐单胞菌发酵生产四氢嘧啶需要高盐环境且产量低的问题，同时解决了利用大肠杆菌发酵生产四氢嘧啶会产生内毒素有潜在的安全问题和大规模发酵经常面临噬菌体污染的问题，对四氢嘧啶工业化生产和大规模应用有重要的实践意义。
[0034](3)本专利技术所提供的高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌构建方法是一种定向的理性的菌种改造本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，在基因组编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因位置和编码二氢嘧啶二羧酸合成酶dapA基因位置整合了由乳糖启动子Ptac控制的T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7 RNAP，同时引入可诱导表达的T7 RNA聚合酶基因；在基因组编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的基因位置整合了由T7强启动子控制来源于谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸激酶lysC基因；导入重组载体pXMJ19
‑
T7
‑
ectABC，构建由T7强启动子控制的L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
半醛到四氢嘧啶的合成通路。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，出发菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC 1.1886。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；编码二氢嘧啶二羧酸合成酶dapA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；乳糖启动子Ptac控制于T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7 RNAP的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因pck的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；T7强启动子控制的天冬氨酸激酶lysC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；重组载体pXMJ19
‑
T7
‑
ectABC的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，T7噬菌体的RNA聚合酶T7 RNAP基因来源于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，ectABC基因簇来源于伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)CGMCC 1.6329。6.一种如权利要求1
‑
5任一所述的构建方法得到的重组谷氨酸棒杆菌。7.一株重组谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)FRD
‑
cgECT
‑
3，其特征在于，该菌株已于2022年07月29日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25427。8.一种如权利要求7所述的重组谷氨酸棒杆菌在发酵四氢嘧啶方面的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，发酵方法包括如下步骤：(1)种子活化：在超净工作台用接种环蘸取菌液，在固体斜面活化培养基中划线，放置于30℃培养箱中培养16
‑
24小时；(2)一级种子培养：在超净工作台用接种环刮取一环菌体，接种到装有30mL一级种子培养基的500mL三角瓶中，用八层纱布封口，在30℃、200
‑
250r/min的条件下振荡培养，OD600生长至1.8
‑
2.0；(3)二级种子培养：按1％
‑
3％接种量转移一级种子到装有二级种子培养基的发酵罐中，温度维持在30℃，溶氧在10％
‑
30％，OD600生长至10
‑
15；(4)发酵培养：按照10％
‑
20％接...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡红涛，李海军，张英华，李珍爱，郑德强，张杰，李艳艳，王超，徐波，张鑫，
申请(专利权)人：山东福瑞达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：