一种促进精氨酸合成的乙酰谷氨酸激酶制造技术

本发明专利技术通过基因工程技术筛选出了一种乙酰谷氨酸激酶突变体SEQ ID NO:11，与野生型乙酰谷氨酸激酶SEQ ID NO:2相比，其促进L

【技术实现步骤摘要】
一种促进精氨酸合成的乙酰谷氨酸激酶


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一种乙酰谷氨酸激酶突变体及其在提高微生物合成L
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精氨酸能力中的用途。

技术介绍

[0002]L
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精氨酸是人体条件性必需氨基酸，具有重要的生理学功能。在体内参与调节免疫系统平衡，增强机体免疫功能，还参与鸟氨酸循环，将体内的氨转化成无毒的尿素排除体外，从而降低血氨浓度(郭长江，徐琪寿.精氨酸体外对免疫细胞功能的调节作用.氨基酸杂志，1991(1):4
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5.)。此外，精氨酸还参与体内一氧化氮、磷酸、肌酸等物质的合成。L
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精氨酸具有重要的经济价值，目前在医药、化妆品、食品、畜牧业等领域有广泛的应用。尤其在医药行业，静脉注射L
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精氨酸能够促进肝脏排毒，对于氨中毒引起的肝昏迷疗效显著，补充精氨酸可有效促进伤口处的胶原蛋白合成，加快受损组织愈合(Sax HC.Arginine stimulates wound healing and immune function in elderly human beings.JPEN J Parenter Enteral Nutr,1994,18(6):559
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560.)。
[0003]目前，蛋白水解法或微生物发酵法是生产精氨酸的主要方法。蛋白水解法就是以廉价的动物毛发和明胶等为原料，在酸性条件下加热，释放氨基酸混合物，最后经离子交换树脂、活性炭脱色等步骤获得L
‑/>精氨酸产品。该方法能够获得L
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型的精氨酸成品，但是存在很多不足：其一是得率偏低，且产品纯度难以达到药品许可标准；其二是工艺复杂，产生大量含盐及有机试剂的废水，造成环境污染。因此，蛋白水解法在大规模应用中受到限制。微生物发酵法是利用基因工程、诱变育种和发酵工程等技术手段，基于微生物自身合成精氨酸，具有生产成本低、产品纯度高、生产条件温和等优点。谷氨酸棒状杆菌和钝齿棒状杆菌常用来作为底盘细胞合成。2014年，Park SH等人利用代谢工程技术改造谷氨酸棒状杆菌ATCC 21831发酵合成L
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精氨酸，在5L和1500L生物反应器中L
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精氨酸的发酵水平分别达到92.5g/L和81.2g/L(Park SH,Kim HU,Kim TY,Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L
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arginine production.Nat.Commun.,2014,5:4618)。但是，利用谷氨酸棒状杆菌具有生产强度低、发酵周期长、生产易波动等缺点，并非最优的生产菌株，且谷氨酸棒状杆菌中涉及L
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精氨酸合成途径的乙酰谷氨酸激酶受到产物L
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精氨酸的反馈抑制(Schendzielorz G,Dippong M,Gr
üꢀ
nberger A,et al.Taking control over control:use of product sensing in single cells to remove flux control at key enzymes in biosynthesis pathways.ACS Synth.Biol.,2014,3(1):21
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29)。

技术实现思路

[0004]为了克服谷氨酸棒状杆菌发酵法生产L
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精氨酸时碰到的产物L
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精氨酸反馈抑制的缺陷，扩大工程菌宿主的范围，专利技术人对L
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精氨酸生物合成途径进行深入了研究，并在乙酰谷氨酸激酶SEQ ID NO:2的改造上取得了突破，利用随机突变及高通量筛选的方法获得
了酶活力提高数倍的突变体，该乙酰谷氨酸激酶突变体能够有效地提高菌株合成L
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精氨酸的能力，并且适用于在基因工程领域最常用的模式菌大肠杆菌实现L
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精氨酸合成。据此，本专利技术提供了如下技术方案。
[0005]一种乙酰谷氨酸激酶，其为选自下组的多肽：
[0006](1)氨基酸序列为SEQ ID NO:11的多肽；
[0007](2)与SEQ ID NO:11有90％以上同源性、优选95％以上、优选96％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:11提高的多肽。
[0008]MNDLIKDLGSEVGANVLAEALPWLQHFRDKIVVVKYGGSAMVDHDLKAAFAADMVFLRTVGAKPVVVHGGGPQISEMLNRVGLQGEFKGGFRVTTPEVMDIVRMVLFGQVGRDLVGLINSHGPYAVGTSGEDAGLFTAQKRMVNIDGVPTDIGLVGDIINVDASSLMDIIEAGRIPVVSTIAPGEDGQIYSINADTAAGALAAAIDAERLLVLTNVEGLYNDWPDKSSLVSKIKATELEAILPGLDSGMIPKMESCLNAVRGGVSAAHVIDGRIAHSVLLELLTMGGIGTMVLPDVFDRENYPEGTVFRKDDKDGEL(SEQ ID NO:11)。
[0009]本专利技术的第二个方面提供了一种多核苷酸，其为编码上述多肽的基因。
[0010]优选地，编码SEQ ID NO:11的基因为SEQ ID NO:10所示的多核苷酸、或者与SEQ ID NO:10有90％以上、优选95％以上、优选96％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性的多核苷酸。
[0011]本专利技术的第三个方面提供了上述的多肽、或者上述的多核苷酸在促进微生物生产L
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精氨酸中的用途。
[0012]具体地，上述微生物可通过发酵生产L
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精氨酸。上述微生物是L
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精氨酸生产菌，选自谷氨酸棒(状)杆菌、钝齿棒状杆菌和大肠杆菌。
[0013]本专利技术的第四个方面提供了一种具有合成L
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精氨酸能力的微生物，其表达上述的基因。
[0014]所述微生物宿主菌选自谷氨酸棒杆菌、钝齿棒状杆菌和大肠杆菌，例如宿主菌可以是谷氨酸棒状杆菌ATCC 21831或者大肠杆菌W3110。
[0015]在一种实施方式中，上述微生物是一种工程菌，即微生物宿主菌基因组中原有的乙酰谷氨酸激酶编码基因被上述的基因替换；或者所述微生物宿主菌基因组中整合了上述的基因。
[0016]上述编码基因的整合可以是通过将包含该基因的质粒转化入所述微生物宿主菌中、或者直接将该基因克隆入宿主菌基因组中而实现。
[0017]其中，将上述的基因克隆入所述微生物宿主菌基因组中、以及某一基因的敲除通过基因编辑技术实施。
[0018]上述基因编辑技术可以采用同源双交换、CRIS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乙酰谷氨酸激酶，其为选自下组的多肽：(1)氨基酸序列为SEQ ID NO:11的多肽；(2)与SEQ ID NO:11有90％以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:11提高的多肽。2.编码如权利要求1所述乙酰谷氨酸激酶的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码SEQ ID NO:11的基因为SEQ ID NO:10所示的多核苷酸、或者与SEQ ID NO:10有90％以上同源性的多核苷酸。4.如权利要求1所述的乙酰谷氨酸激酶、或者如权利要求2
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3中任一项所述的基因在促进微生物生产L
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精氨酸中的用途。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述微生物是L
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精氨酸生产菌，选自谷氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金刚，韦炎龙，梁岩，
申请(专利权)人：上海邦林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：