基因PlYPK1及其在防治荔枝霜疫病中的应用制造技术

本发明专利技术公开了基因PlYPK1及其在防治荔枝霜疫病中的应用，属于农作物病害绿色防控技术领域。本发明专利技术应用基于聚乙二醇介导的原生质体转化技术与CRISPR/Cas9敲除策略，通过构建PlYPK1敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化，利用同源重组的方法将基因PlYPK1从荔枝霜疫霉中敲除，获得敲除突变体。该突变体与野生型相比，生长速率基本一致，致病力明显减弱，卵孢子产量显著减少。本发明专利技术证实PlYPK1是荔枝霜疫霉生长发育、侵染致病所必须的。我们的研究有助于深入阐明荔枝霜疫霉的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。开发有效杀菌剂提供了靶标基因。开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

【技术实现步骤摘要】
基因PlYPK1及其在防治荔枝霜疫病中的应用


[0001]本专利技术属于农作物病害绿色防控
，具体涉及基因PlYPK1及其在防治荔枝霜疫病中的应用。

技术介绍

[0002]荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)侵染引起的病害为荔枝霜疫病，其寄主植物是荔枝。该病原菌属于鞭毛菌亚门，卵菌纲(Oomycetes)，霜霉目(Peronosporales)，霜疫霉科(Peronophthoraceae)。由荔枝霜疫霉引起的荔枝霜疫病在荔枝上危害最为严重，且尚未发现有效的抗病荔枝种植品种。目前对荔枝霜疫霉的防治仍然是以农药防治为主，其抗药性风险大并且污染环境，因此研究荔枝霜疫霉的致病机制有非常重要的意义。
[0003]研究表明，荔枝霜疫霉成功侵染荔枝主要依赖于一系列致病因子。因此，充分挖掘荔枝致病相关基因并开展功能研究，对有效控制荔枝霜疫霉的危害和选育抗病品种具有重要意义。
[0004]YPK1蛋白是一种参与信号传导的丝氨酸
‑
苏氨酸激酶，是AGC蛋白激酶家族的成员，荔枝霜疫霉中PlYPK1在致病机制中发挥重要功能。在酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)中，ScYPK1的缺失会导致酿酒酵母生长缺陷；在大豆疫霉(Phytophthora sojae)中，PsYPK1参与孢子囊的和卵孢子的形成，PsYPK1敲除后的转化子对大豆下胚轴致病力显著降低。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的缺陷或不足，本专利技术的首要目的在于提供一种荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供上述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1相关的生物材料。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供上述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1或生物材料的应用。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]本专利技术公开了荔枝霜疫霉一个此前未知的蛋白PlYPK1及其编码基因PlYPK1。基因PlYPK1的全长如SEQ ID NO.1所示，其CDS序列如SEQ ID NO.2所示，共编码876个氨基酸，如SEQ ID NO.3所示。本专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建pBSSK::PlYPK1和PYF2.3G
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ribo
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sgRNA1::PlYPK1和PYF2.3G
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ribo
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sgRNA2::PlYPK1敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化技术敲除PlYPK1基因。最终获得敲除突变体T13、T28、T52(按照转化子验证顺序编号命名)，三个突变体在荔枝霜疫霉生长发育过程中存在明显缺陷。致病性测定结果表明，基因PlYPK1的敲除突变体T13、T28、T52对荔枝嫩叶(品种：糯米糍)的致病力显著降低。上述试验证明荔枝霜疫霉PlYPK1基因为荔枝霜疫霉的致病相关基因。将PlYPK1在荔枝霜疫霉中回
补，得到一回补转化子C，经致病力测定后发现PlYPK1基因回补后致病力恢复。
[0010]一种荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是如SEQ ID NO.3通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示。
[0011]上述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
[0012]1)编码所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的核酸分子；
[0013]2)含有1)中所述核酸分子的表达盒；
[0014]3)含有1)中所述核酸分子的重组载体，或含有2)中所述表达盒的重组载体；
[0015]4)含有1)中所述核酸分子的重组微生物，或含有2)中所述表达盒的重组微生物，或含有3)所述重组载体的重组微生物；
[0016]5)抑制或阻断所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的基因表达的核酸序列；
[0017]6)利用5)中所述核酸序列制备得到的抑制或阻断所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的基因表达的基因敲除载体；
[0018]7)利用6)中所述基因敲除载体制备得到的所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的基因缺陷型荔枝霜疫霉。
[0019]进一步地，1)中所述核酸分子为所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的基因序列，如SEQ ID NO:1所示，或者是所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的CDS序列，如SEQ IDNO:2所示，或者是如SEQ ID NO.1通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示。
[0020]进一步地，5)中所述核酸序列为PlYPK1基因的反义RNA、siRNA、shRNA或sgRNA。
[0021]更进一步地，所述sgRNA如下任意一种序列所示：
[0022]sgRNA1：5'
‑
TTTGTGCGCCAATCCGGACGAGCTTACTCGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAGCGGATTGCTAG
‑
3'；
[0023]sgRNA2：5'
‑
TTTAGCGCCGAAGGAAGACGAGCTTACTCGTTTCGTCCTCACGGACTC ATCAGTTCCTTGCTAG
‑
3'。
[0024]上述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1或生物材料的应用，为下述应用中的任意一种或多种组合：
[0025]ⅰ
)在调控荔枝霜疫霉致病力中的应用；
[0026]ⅱ
)在调控荔枝霜疫霉致病相关基因表达水平中的应用；
[0027]ⅲ
)在调控荔枝霜疫霉生长中的应用；
[0028]ⅳ
)在调控荔枝霜疫霉卵孢子形成中的应用；
[0029]ⅴ
)在防治荔枝霜疫病中的应用；
[0030]ⅵ
)作为靶点在设计和筛选抗荔枝霜疫霉药物中的应用。
[0031]一种防治由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病的方法，通过抑制或阻断所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的基因表达实现。
[0032]一种抗荔枝霜疫霉药物筛选模型，所述的药物筛选模型为所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的基因缺陷型荔枝霜疫霉。
[0033]上述抗荔枝霜疫霉药物筛选模型的构建方法，包括如下步骤：
[0034](1)根据PlYPK1基因序列利用sgRNA网站设计sgRNA，将sgRNA与pYF2.3G
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Ribo
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sgRNA载体进行连接，得到PlYPK1基因敲除质粒pYF2.3G
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Ribo
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sgRNA::PlYPK1；
[0035]或者，根据PlYPK1基因序列上游、下游各约1kb的序列设计左、右同源臂扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是如SEQ ID NO.3通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示。2.权利要求1中所述的荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1相关的生物材料，其特征在于：为下述生物材料中的任意一种或多种组合：1)编码所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的核酸分子；2)含有1)中所述核酸分子的表达盒；3)含有1)中所述核酸分子的重组载体，或含有2)中所述表达盒的重组载体；4)含有1)中所述核酸分子的重组微生物，或含有2)中所述表达盒的重组微生物，或含有3)所述重组载体的重组微生物；5)抑制或阻断所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的基因表达的核酸序列；6)利用5)中所述核酸序列制备得到的抑制或阻断所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的基因表达的基因敲除载体；7)利用6)中所述基因敲除载体制备得到的所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的基因缺陷型荔枝霜疫霉。3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：1)中所述核酸分子为所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的基因序列，如SEQ ID NO:1所示，或者是所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的CDS序列，如SEQ ID NO:2所示，或者是如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO:2通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示；5)中所述核酸序列为PlYPK1基因的反义RNA、siRNA、shRNA或sgRNA。4.权利要求1中所述的荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1或权利要求2
‑
3任一项中所述的生物材料的应用，其特征在于：为下述应用中的任意一种或多种组合：
ⅰ
)在调控荔枝霜疫霉致病力中的应用；
ⅱ
)在调控荔枝霜疫霉致病相关基因表达水平中的应用；
ⅲ
)在调控荔枝霜疫霉生长中的应用；
ⅳ
)在调控荔枝霜疫霉卵孢子形成中的应用；
ⅴ
)在防治荔枝霜疫病中的应用；
ⅵ
)作为靶点在设计和筛选抗荔枝霜疫霉药物中的应用。5.一种防治由荔枝霜疫霉导致的荔枝霜疫病的方法，其特征在于：通过抑制或阻断权利要求1中所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的基因表达实现。6.一种抗荔枝霜疫霉药物筛选模型，其特征在于：所述的药物筛选模型为权利要求1中所述荔枝霜疫霉致病相关蛋白PlYPK1的基因缺陷型荔枝霜疫霉。7.权利要求6中所述的抗荔枝霜疫霉药物筛选模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)根据PlYPK1基因序列利用sgRNA网站设计sgRNA，将sgRNA与pYF2.3G
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【专利技术属性】
技术研发人员：习平根，刘茜芫，谢文彬，李小凤，袁玉花，李敏慧，孔广辉，司徒俊键，姜子德，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：