一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法技术

本申请涉及分子检测领域，更具体地说，它涉及一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法。改性分子酶的制备方法：枯草芽孢杆菌的制备；枯草芽孢杆菌置于DES溶液中/紫外环境下处理得到待用菌溶液A/B；将待用菌溶液A、B混合，加助溶剂，离心、弃上清；将其做成pH6.0

【技术实现步骤摘要】
一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法


[0001]本申请涉及分子检测领域，更具体地说，它涉及一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法。

技术介绍

[0002]分子免疫层析检测是近年来快速发展的一种快速免疫检测技术。目前检测病毒一般是通过检测试剂盒检测的，检测方法是先加入裂解液将人体或动物样本中的核酸提取出来，然后通过吸附、洗脱等纯化核酸，再往核酸中加入酶进行等温扩增后，加入试剂盒中检测。
[0003]由于只有在强碱条件下，才能让组织中的病毒破坏，从而释放核酸片段。前期为了提高灵敏度需要进行对核酸进行提取纯化，再进行等温扩增，是提取核酸和等温扩增两步同等重要，缺一不可，并且核酸的提取物以及纯化操作通常都比较复杂。这样无疑增加整个检测时间；因此，如何进一步简化操作、提高效率成了需要解决的问题。

技术实现思路

[0004]为了简化操作、提高效率，本申请提供一种改性分子酶的制备方法及其分子免疫层析检测方法。
[0005]第一方面，本申请提供一种改性分子酶的制备方法，采用如下的技术方案：一种改性分子酶的制备方法，包括以下步骤：枯草芽孢杆菌制备，得到原生质体；将原生质体置于硫酸二乙酯(DES)溶液中处理，得到待用菌溶液A；将原生质体置于紫外环境下处理，得到待用菌溶液B；将待用菌溶液A、待用菌溶液B混合，加入助溶剂共混，离心后弃去上清液，清洗后得到待筛选原生质体；将待筛选原生质体放入再生培养基中，做成pH6.0
‑
12.0的梯度坡面培养皿，取存活原生质体；然后再将存活原生质体涂布于25
‑
50mg/ml的庆大霉素的梯度斜面上，培养18
‑
25天，挑选存活的菌落进行培养；从培养的菌落放到发酵培养基中进行发酵培养，得到菌液，从菌液中提取分子酶将分子酶与1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液、N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液混合，配置成分子酶溶液，分子酶溶液的浓度为20
‑
200mg/ml；按体积份数，取15
‑
25份EDC溶液和35
‑
45份NHS溶液，加入到分子酶溶液中反应；离心，去上清，离心得到的剩余部分用MES溶液复溶，并加入PEG
‑
聚精氨酸(Poly
‑
L
‑
Arginine)，避光反应；加入封闭液，旋转封闭反应；离心，去上清，得到改性分子酶；分子酶为μvsX酶、μvsY酶、GP32酶、Bsμ酶、Nfo酶、Creatine kinase M
‑
type酶中的
一种。
[0006]本申请是对等温扩增酶的进行改性，使其具有抗碱性以及耐热稳定性。在检测时，无需对样本进行核酸提取，在恶劣的核酸裂解环境中所使用等温扩增酶全部依旧具备很好的活性，能实现核酸的等温扩增，从而使得核酸的提取以及等温扩增可以同步反应，只需直接加入释放剂以及酶，在室温下放置5
‑
10分钟即可完成。可以有效简化操作的步骤，缩短检测时间，提高效率。
[0007]具体的，对分子酶的改性主要是通过修改酶结果中的酸性氨基酸变成碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)，用精氨酸取代酶表面的苯丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺实现的，可以达到提高酶的热稳定性的效果。
[0008]选用特定的EDC溶液对酶进行活化，在酸性条件下，有利于提高活化反应的效率，促使酶中的
‑
COOH(羧基)与聚精氨酸偶联。在EDC溶液和NHS溶液的共同配合下，活化反应可以更加稳定进行，定向促使酶活化。
[0009]优选的，所述待用菌溶液A的处理包括以下步骤：取原生质体，配置成原生质体悬浮液；将DES溶液与原生质体悬浮液混合，配置至DES终浓度为0.7
‑
1.0％；混合均匀后，置于35
‑
42℃处理30
‑
120min，得到待用菌溶液A。
[0010]通过采用上述技术方案，将原生质体悬浮液置于DES溶液中，对其进行诱导反应，该处理方法简单、效率高，可以得到大量符合要求、具有良好抗碱效果的菌群。
[0011]优选的，所述待用菌溶液B的处理包括以下步骤：取原生质体配置成原生质体悬浮液；在10
‑
25W、250
‑
300nm的条件下对原生质体悬浮液进行紫外处理，处理时间为90
‑
160s，避光，得到待用菌溶液B。
[0012]通过采用上述技术方案，在特定功率、特定波长的紫外照射下对原生质体悬浮液进处理，诱变DNA使其发生特殊的改变。
[0013]优选的，取所述EDC溶液和NHS溶液加入到分子酶溶液中反应时，EDC溶液和NHS溶液的体积比为1:(2
‑
3)。
[0014]通过采用上述技术方案，进一步限定EDC溶液和NHS溶液之间的使用比例，提高活化酶的效率，促使目标蛋白酶可以往特定的方向进行偶联。
[0015]优选的，所述助溶剂为硝酸钠、聚乙二醇、二甲亚砜中的一种。
[0016]优选的，所述助溶剂为聚乙二醇。
[0017]通过采用上述技术方案，加入助溶剂促使原生质体融合。助溶剂使分离的原生质体彼此黏附，导致紧密黏着，产生融合。
[0018]专利技术人在经过多次试验之后，发现当助溶剂为聚乙二醇时，所制得改性分子酶的效果最好。
[0019]第二方面，本申请提供一种分子免疫层析检测方法，采用如下的技术方案：一种分子免疫层析检测方法，包括以下步骤：将1
‑
3g待测样品加入到95
‑
105μl核酸释放剂，在95
‑
100℃下处理2
‑
5min，得到待检测模板；然后将2
×
10
‑4‑3×
10
‑4μmol/l的改性分子酶和1
‑
2μl待检测模板混合，混合均匀后加入0.8
‑
1.5μl激活剂，在35
‑
40℃下反应20
‑
45min，得到反应产物；
将反应产物用反应缓冲液稀释45
‑
50倍，插入试剂，观察结果。
[0020]溶解剂为PB缓冲液，反应缓冲剂包括10mmol/L磷酸肌酸钠、0.3mg/mL BSA、3％甲酰胺、10mmol/L DTT、150μmol/L dATP、150μmol/LdTTP、150μmol/L dCTP、150μmol/L dGTP、150μmol/L dUTP，激活剂为20mM醋酸镁，反应缓冲液包括0.01mol/L Tris
‑
HCl(pH8.0)、0.85％ NaCl、0.5％ Tween20。
[0021]本方法是一种新型核酸等温扩增技术，该技术无需温度循环，通过模拟生物体内本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改性分子酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：枯草芽孢杆菌制备，得到原生质体；将原生质体置于DES溶液中处理，得到待用菌溶液A；将原生质体置于紫外环境下处理，得到待用菌溶液B；将待用菌溶液A、待用菌溶液B混合，加入助溶剂促融合，离心后弃去上清液，清洗后得到待筛选原生质体；将待筛选原生质体放入再生培养基中，做成pH6.0
‑
12.0的梯度坡面培养皿，取存活原生质体；然后再将存活原生质体涂布于25
‑
50mg/ml的庆大霉素的梯度斜面上，培养18
‑
25天，挑选存活的菌落进行培养；培养的菌落进行发酵培养后从菌液中提取分子酶；将分子酶与EDC溶液、NHS溶液混合，配置成分子酶溶液，分子酶溶液的浓度为20
‑
200mg/ml；按体积份数，取15
‑
25份EDC溶液和35
‑
45份NHS溶液，加入到分子酶溶液中反应；离心，去上清，离心得到的剩余部分用MES溶液复溶，并加入PEG
‑
聚精氨酸，避光反应；加入封闭液，旋转封闭反应；离心，去上清，得到改性分子酶；分子酶为μvsX酶、μvsY酶、GP32酶、Bsμ酶、Nfo酶、creatine kinase M
‑
type酶中的一种。2.根据权利要求1所述的改性分子酶的制备方法，其特征在于：所述待用菌溶液A的处理包括以下步骤：取原生质体，配置成原生质体悬浮液；将DES溶液与原生质体悬浮液混合，配置至DES终浓度为0.7
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1.0%；混合均匀后，置于35
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42℃处理30
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120min，得到待用菌溶液A。3.根据权利要求1所述的改性分子酶的制备方法，其特征在于：所述待用菌溶液B的处理包括以下步骤：取原生质体，配置成原生质体悬浮液；在10
‑
25W、250
‑
300nm的条件下对原生质体悬浮液进行紫外处理，处理时间为90
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160s，避光，得到待用菌溶液B。4.根据权利要求1所述的改性分子酶的制备方法，其特征在于：取...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝基贤，邵南津，黄彩兰，华松婷，
申请(专利权)人：深度进化广州生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：