口虾蛄致敏蛋白AK的突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种口虾蛄致敏蛋白AK的突变体及其应用，所述突变体是将口虾蛄致敏蛋白AK氨基酸序列的第197位丙氨酸删除，所述口虾蛄致敏蛋白AK突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。根据本发明专利技术的口虾蛄致敏蛋白AK的突变体，通过重叠延伸聚合酶链式反应技术获得口虾蛄AK突变体的基因序列；将突变体的基因与重组表达载体连接，转入宿主细胞中诱导表达，获得口虾蛄AK突变体D

【技术实现步骤摘要】
NO：9、SEQ ID NO：10为引物进行重叠延伸PCR第一轮扩增，获得第一产物；
[0016](2)以所述第一产物模板，SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8为引物进行重叠延伸PCR第二轮扩增，获得第二产物，所述第二产物经扩增回收，获得突变基因；
[0017](3)将所述突变基因克隆入原核表达载体中，构建重组载体；
[0018](4)将所述重组载体转入宿主菌，诱导其表达并纯化蛋白，以获得所述突变体。
[0019]可选地，所述pET
‑
22b
‑
AK菌株的制备包括：
[0020](1)以口虾蛄cDNA为模板，SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6为引物进行PCR扩增，获得第三产物；
[0021](2)将所述第三产物与pEASY
‑
T1质粒连接，得到口虾蛄pEASY
‑
T1
‑
AK质粒；
[0022](3)以pEASY
‑
T1质粒为模板，SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8为引物进行PCR扩增，获得第四产物；
[0023](4)将所述第四产物与pEASY
‑
T1质粒连接，得到连接产物，连接产物转化到Trans
‑
T1感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR验证；
[0024](5)将测序正确的菌株以及表达载体pET
‑
22b菌株在37℃下活化过夜，收集菌体，提取质粒进行双酶切，将酶切产物连接并构建重组载体转入宿主菌，即得pET
‑
22b
‑
AK菌株。
[0025]在本专利技术的第五方面中，根据本专利技术实施例，本专利技术还提出了上述口虾蛄致敏蛋白AK的突变体在制备预防或治疗虾类过敏性疾病的药物中的应用。
[0026]根据本专利技术的实施例，通过上述的口虾蛄致敏蛋白AK的突变体在制备的药物应用与抗原特异性疗法中，可以大大减少免疫治疗中的副作用，提高治疗的安全指数。
[0027]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0028]图1为口虾蛄AK基因的克隆表达，其中M为核酸Marker，图1(A)为AK的基因克隆，图1(B)为菌落PCR验证，图1(C)为pEASY
‑
T1
‑
AK质粒双酶切电泳图，图1(D)为pET
‑
22b质粒双酶切电泳图；
[0029]图2为口虾蛄AK的SDS
‑
PAGE(A)及Western blot(B)分析；
[0030]图3为口虾蛄AK突变体D
‑
A197的SDS
‑
PAGE(A)及Western blot(B)分析；
[0031]图4为口虾蛄AK和突变体D
‑
A197与口虾蛄过敏患者血清IgE结合活性分析。
具体实施方式
[0032]下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0033]下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本专利技术的不同实施方式。为了简化本专利技术的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本专利技术。此外，本专利技术提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本专利技术的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非
另有说明，在本文中，核酸以5
’
至3
’
的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
[0034]下面通过说明性的具体实施例对本专利技术进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本专利技术的范围。特别说明的是：本专利技术所用到的试剂除特别说明外均有市售。
[0035]实施例1口虾蛄致敏蛋白AK的突变体D
‑
A197的克隆
[0036](1)AK引物的设计及合成
[0037]利用Primer 5.0软件设计口虾蛄AK的上下游引物(F，R)，在上下游引物的基础上分别加上Nde I和Sal I限制性内切酶的酶切位点(F
’
，R
’
)。实验所用引物均由厦门瑞辰铂生物技术有限公司合成。
[0038]F:5
’‑
ATGGCTGACGCTGCTGTTATTGA
‑3’
；(SEQ ID NO:5)
[0039]R:5
’‑
CATCTCCTTCTCCATCTTGATGAGC
‑3’
；(SEQ ID NO:6)
[0040]F
’
:5
’‑
CATATGATGGCTGACGCTGCTGTTATTGA
‑3’
；(SEQ ID NO:7)
[0041]R
’
:5
’‑
GTCGACCATCTCCTTCTCCATCTTGATGAGC
‑3’
；(SEQ ID NO:8)
[0042](2)口虾蛄AK的克隆
[0043]口虾蛄总RNA的提取按试剂盒说明书方法，提取的RNA在检测其浓度和纯度后贮存于
‑
80℃备用。按照PrimeScript
TM II 1st Strand cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA。以口虾蛄cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系如表1所示。
[0044]表1 PCR扩增体系
[0045][0046]PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶后采用DNA纯化试剂盒纯化，回收，贮存于
‑
20℃备用。将回收后的片段与pEASY
‑
T1载体于25℃连接20min，连接体系如表2所示。将连接产物转化到Trans
‑
T1感受态细胞中，挑取单菌落进行菌落PCR验证，选取阳性克隆子至厦门瑞辰铂生物科技有限公司测序，所得序列即为口虾蛄致敏蛋白AK的开放阅读框，如SEQ ID NO:3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4。
[0047]表2 pEASY
‑
T1连接体系
[0048][0049](3)pET
‑
22b
‑
AK重组质粒的构建
[0050]以口虾蛄pEASY
‑
T1
‑
AK质粒为模板，分别以F
’
和R
’
作为引物进行PCR扩增，扩增体系参见表1。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种口虾蛄致敏蛋白AK的突变体，其特征在于，所述突变体是将口虾蛄致敏蛋白AK氨基酸序列的第197位丙氨酸删除，所述口虾蛄致敏蛋白AK突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种编码如权利要求1所述的口虾蛄致敏蛋白AK的突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.一种重组载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的基因。4.一种制备口虾蛄致敏蛋白AK的突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以pET
‑
22b
‑
AK菌株所得的质粒为模板，SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10为引物进行重叠延伸PCR第一轮扩增，获得第一产物；(2)以所述第一产物为模板，SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8为引物进行重叠延伸PCR第二轮扩增，获得第二产物，所述第二产物经扩增回收，获得突变基因；(3)将所述突变基因克隆入原核表达载体中，构建重组载体；(4)将所述重组载体转入宿主菌，诱导其表达并纯化蛋白，以获得所述突变体。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pET
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光明，陈业欣，何欣蓉，杨阳，桓霏，杨世强，刘红，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：