含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因及其应用。具体公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的融合蛋白以及包括嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体的编码基因的核酸分子(SEQ ID No.3)。本发明专利技术通过设计含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因，将PD

【技术实现步骤摘要】
含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体(Chimeric Switch Receptor，CSR)编码基因的融合基因及其应用。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)技术是采用基因工程技术修饰免疫细胞，使其表达外源性抗肿瘤基因，使得淋巴细胞等免疫细胞具有识别肿瘤细胞表面抗原的能力，并特异性识别和杀伤肿瘤细胞。近年来，CAR
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T细胞治疗在B细胞等血液系统肿瘤中取得了令人鼓舞的疗效，然而其在血液肿瘤中的巨大成功尚未能在实体瘤中得以复制。实体瘤不同于血液系统肿瘤，CAR
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T细胞在进入实体瘤时需要克服肿瘤细胞固有的异质性和抑制性的肿瘤微环境的复杂性，而肿瘤微环境的免疫抑制性及其结构的复杂性是T细胞免疫疗法广泛应用于实体瘤的主要障碍。
[0003]特异性识别肿瘤抗原只是CAR
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T成功的第一步。肿瘤为了存活给自己创建了一个免疫抑制性的微环境，这个环境对于CAR
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T是不友好的。肿瘤细胞的糖酵解使环境缺氧、呈酸性、营养耗竭。CAR
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T功能的执行也需要糖酵解和氧化磷酸化，但是糖被肿瘤细胞耗尽了，CAR
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T细胞的效应功能因而受损。在炎症环境中，肿瘤细胞通常会上调抑制性配体，如PD
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L1和Galectin
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9等。此外，肿瘤微环境还有大量抑制性免疫细胞和基质细胞，如肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)、髓性抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)、肿瘤相关中性粒细胞(TANS)、肥大细胞和调节性T细胞(Tregs)。这些细胞和肿瘤细胞分泌的VEGF，TGF
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β等能够导致肿瘤血管畸形，促进TAMS等免疫细胞的抗炎极化，参与上皮细胞间质转化(EMT)。它们还能产生活性氧(ROS)和诸如乳酸、吲哚胺2，3
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双加氧酶(Ido)、前列腺素e2(PGE2)、可溶性脂肪酸和腺苷等分子，形成抑制性的免疫微环境。近期有研究表明，CAR
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T细胞治疗后肿瘤微环境的免疫抑制作用变得更强了。
[0004]鉴于此，如何对CAR
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T细胞进行相应的结构改造来克服免疫抑制的肿瘤微环境、进而提高临床治疗效果是CAR
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T细胞治疗仍然面临的严峻挑战。研究和开发新的具有强大抗肿瘤作用的CAR
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T细胞对肿瘤的免疫细胞治疗具有重要的理论意义和应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是如何预防或治疗肿瘤(如表达GPC3抗原的肿瘤)和/或调节肿瘤微环境的免疫抑制作用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了核酸分子，所述核酸分子可包括嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)的编码基因和嵌合转换开关受体(Chimeric Switch Receptor，CSR)的编码基因。
[0007]进一步地，上述核酸分子中，所述嵌合转换开关受体可包括TGFβ受体II型胞外区
(转化生长因子β的II型受体胞外区)、μPD
‑
1和CD27跨膜区和胞浆区，所述μPD
‑
1可为突变优化的PD
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1的胞外区，其氨基酸序列可为SEQ ID No.1的第187
‑
332位。
[0008]进一步地，上述核酸分子中，所述嵌合转换开关受体的编码基因可为下述任一种：
[0009]B1)编码融合蛋白的核酸分子；
[0010]B2)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
[0011]B3)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
[0012]所述融合蛋白可为下述任一种：
[0013]A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
[0014]A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
[0015]A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
[0016]所述融合蛋白可为嵌合转换开关受体(Chimeric Switch Receptor，CSR)。
[0017]所述融合蛋白及其编码基因可用于提高CAR细胞抵御免疫抑制性肿瘤微环境的能力、使CAR细胞具有更强的体内持久性和/或抑制PD
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1和TGFβ信号通路以增强CD27信号通路的效果。
[0018]所述融合蛋白的编码基因可用于制备本专利技术所述的核酸分子或含有本专利技术所述核酸分子的CAR细胞。
[0019]本文所述标签包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His
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tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
[0020]本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本专利技术的编码融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的、具有与本专利技术融合蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述融合蛋白且具有所述融合蛋白的功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。
[0021]上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
[0022]本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
[0023]本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
[0024]进一步地，上述核酸分子中，所述核酸分子还可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括嵌合抗原受体的编码基因和嵌合转换开关受体的编码基因。2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述嵌合转换开关受体包括TGFβ受体II型胞外区、μPD
‑
1和CD27跨膜区和胞浆区，所述μPD
‑
1的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第187
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332位。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述嵌合转换开关受体的编码基因为下述任一种：B1)编码融合蛋白的核酸分子；B2)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；B3)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子；所述融合蛋白可为下述任一种：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。4.根据权利要求1
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3中任一所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子还包括IFNα基因和/或P2A基因。5.根据权利要求1
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3中任一所述的核酸分子，其特征在于，所述嵌合抗原受体的编码基因为靶向GPC3的嵌合抗原受体的编码基因。6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述靶向GPC3的嵌合抗原受体的编码基因为下述任一种：C1)编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质的核酸分子；C2)编码序列是SEQ ID No.3第1
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1473位的DNA分子；C3)核苷酸序列是SEQ ID No.3第1
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1473位的DNA分子。7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：D1)核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建高，杨鑫，杨文君，
申请(专利权)人：浙江康佰裕生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：