一种免疫细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种核酸构建物、免疫细胞及其制备方法与应用，所述的核酸构建物包括顺序连接的：胞外抗原结合区编码序列、跨膜区编码序列、胞内信号转导区编码序列组成的CAR分子编码序列，以及sGP130或其融合蛋白编码序列；sGP130或其融合蛋白编码序列和CAR分子编码序列之间由剪切肽连接，所述剪切肽包括：F2A，T2A，E2A或P2A。本发明专利技术将sGP130同时联合使用CAR

【技术实现步骤摘要】
一种免疫细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于细胞免疫治疗
，具体涉及一种免疫细胞及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]免疫细胞在肿瘤免疫治疗中的作用日益受到重视。自然杀伤细胞（NK）是机体核心的天然免疫细胞，T淋巴细胞是机体重要的适应免疫应答细胞。NK和T细胞在肿瘤免疫监视中都发挥主要作用。近年来，肿瘤免疫细胞治疗因其显著的疗效而在肿瘤治疗中备受瞩目，特别是基于嵌合抗原受体改造的T/NK细胞（CAR
‑
T/NK）.CAR
‑
T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤的临床治疗上展现出良好的靶向性、杀伤力和持久性，成为肿瘤过继免疫治疗的典型代表。但是，CAR
‑
T细胞治疗仍然存在多种问题，如CAR
‑
T细胞的临床治疗研究结果显示，其本身所引起的细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome, CRS）威胁着患者生命。CRS以白细胞介素
‑
6(interleukin 6，IL
‑
6)作为检测指标，IL6的拮抗剂也成为了目前主要用于控制严重CRS的手段，以降低了严重CRS 导致CAR
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T细胞治疗失败的风险。
[0003]IL
‑
6也是最具特色的促进癌细胞因子的细胞因子之一，在免疫细胞释放的各种炎性因子中，IL
‑
6被认为是衔接炎症与肿瘤的最核心的炎性因子，亦是引发细胞因子风暴的关键炎症因子。IL
‑
6和IL
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6R的结合包括膜结合（mIL
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6R）和可溶性IL
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6R（sIL
‑
6R）两种，分别称为经典或非经典信号传导，两条信号传导途径产生的生物学差异较大。经典的信号通路能够再生并具有保护作用，非经典信号通路却促进炎症的发生。在非经典途径中，IL
‑
6通过和非信号传导sIL
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6Rα结合形成蛋白复合体，随后与亚基糖蛋白130(Glycoprotein 130，gp130)二聚化，通过转录因子、Janus激酶（JAKs）和信号转导子、以及转录激活因子(STATs)启动信号转导级联，不仅能够促进肿瘤继续细胞增殖，抑制肿瘤微环境免疫水平，还引起病人的高热、神经损伤甚至死亡。
[0004]尽管免疫细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但是IL
‑
6释放造成炎症微环境，引发患者的细胞因子风暴，促进肿瘤生长或者免疫逃逸。因此，本领域仍然需要进行进一步的研究，以期进一步提高免疫效应细胞对于肿瘤免疫治疗的疗效，减少毒副作用。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种核酸构建物、载体、免疫细胞及其制备方法与应用，所述免疫细胞杀伤肿瘤的能力得到显著增强，同时联合使用CAR
‑
T细胞后，也提高了其对实体瘤的杀伤效果，以及提高了其体内的安全性。
[0006]本专利技术的目的是提供一种核酸构建物。
[0007]本专利技术的目的是提供一种含有上述核酸构建物的载体。
[0008]本专利技术的另一目的是提供含有上述核酸构建物的免疫细胞及其制备方法。
[0009]本专利技术的再一目的是提供上述免疫细胞的应用。
[0010]根据本专利技术的具体实施方式的核酸构建物，其编码用于修饰免疫细胞的融合多
肽，所述的核酸构建物包括顺序连接的：胞外抗原结合区编码序列、跨膜区编码序列、胞内信号转导区编码序列，以及sGP130或其融合蛋白编码序列。
[0011]所述的可溶性GP130的融合蛋白包括但不限于：可溶性 sGP130与Fc的融合肽，或者，可溶性 sGP130与CH3 结构域的融合肽。
[0012]本专利技术中，在核酸构建物或免疫细胞中处理/过表达sGP130，降低了CAR
‑
T在治疗过程中的副作用，同时保留了抗肿瘤作用。
[0013]进一步的，胞外抗原结合区编码序列，跨膜区，胞内信号转导区编码序列组成CAR分子编码序列，所述的 sGP130或其融合蛋白编码序列和CAR分子编码序列之间由剪切肽连接，所述剪切肽包括：F2A，T2A，E2A或P2A。
[0014]其中，所述胞外抗原结合区是特异性结合肿瘤高表达的抗原的抗体。
[0015]进一步的，所述胞外抗原结合区识别任意肿瘤特异性或相关性抗原，识别任意的肿瘤特异性或相关性抗原包括HER2，EphA2，GD2，EpCAM，PD
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1、PD
‑
L1、LeY，CEA， EGFR，GPC3， mesothelin，CD19，CD20，ASGPR1，EGFRvIII，de4EGFR，NY
‑
ESO
‑
1，MAGE4，CD19，CAIX，CD123、CD33，IL13R，LMP1，PLAC1， MUC1，MUC16；所述跨膜区和胞内信号转导区选自CD8、CD28 TM+ICD、4
‑
1BB、DAP10、DAP12、NKG2D、DNAM1、CD3ζ中的任意一种或至少两种分子的胞内结构域组合。
[0016]进一步的，所述sGP130包括氨基酸1
‑
558aa，氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1 所示；优选地，所述sGP130的编码基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。该片段能够特异性结合IL6的反式信号通路，是本实验室通过实验验证后从多个片段中选出的最佳片段，与已知现有的GP130胞外段长短不同。
[0017]进一步的，所述的胞外抗原结合区编码序列前端加入了FLAG、His或HA标签，有利于检测目的基因的表达。
[0018]一种载体，所述载体含有所述的核酸构建物。
[0019]所述CAR识别激活诱导过表达体系中，质粒载体包括pCDH
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CMV
‑
MCS
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EF1
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Puro、pCDH
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CMV
‑
MCS
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EF1
‑
EGFP、pCDH
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CMV
‑
MCS
‑
EF1
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EGFP
‑
T2A
‑
Puro、pCDH
‑
CMV
‑
MCS
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P2A
‑
EGFP
‑
T2A
‑
Puro中的任意一种。
[0020]优选地，过表达采用的载体包括病毒载体或PB载体。
[0021]优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体中的任意一种或至少两种的组合。
[0022]优选为慢病毒载体，进一步优选为慢病毒载体pCDH
‑
CMV
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸构建物，其特征在于，所述的核酸构建物包括顺序连接的：胞外抗原结合区编码序列、跨膜区编码序列、胞内信号转导区编码序列，以及sGP130或其融合蛋白编码序列。2.根据权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，胞外抗原结合区编码序列，跨膜区，胞内信号转导区编码序列组成CAR分子编码序列，所述的 sGP130或其融合蛋白编码序列和CAR分子编码序列之间由剪切肽连接，所述剪切肽包括：F2A，T2A，E2A或P2A。3.根据权利要求2所述的核酸构建物，其特征在于，所述胞外抗原结合区识别任意肿瘤特异性或相关性抗原，包括HER2，EphA2，GD2，EpCAM，PD
‑
1、PD
‑
L1、LeY，CEA， EGFR，GPC3， mesothelin，CD19，CD20，ASGPR1，EGFRvIII，de4EGFR，NY
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ESO
‑
1，MAGE4，CD19，CAIX，CD123、CD33，IL13R，LMP1，PLAC1， MUC1，MUC16；所述跨膜区和胞内信号转导区选自CD8、CD28 TM+ICD、4
‑
1BB、DAP10、DAP12、NKG2D、DNAM1、CD3ζ中的任意一种或至少两种分子的胞内结构域组合。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的核酸构建物，其特征在于，所述sGP130包含氨基酸1
‑
558...

【专利技术属性】
技术研发人员：李静，李明风，戚欣，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：