抗PD-L1抗体、其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及抗PD

【技术实现步骤摘要】
抗PD
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L1抗体、其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及抗PD
‑
L1抗体、其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]免疫系统必须在有效应答以清除致病体与保持耐受以防止自身免疫疾病之间实现平衡。T细胞对于保持这种平衡是关键的，它们的适当的调节主要是通过B7
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CD28家族的分子协调进行。B7家族成员(其行使配体的功能)和CD28家族成员(其行使受体的功能)之间的相互作用不仅提供了关键的正信号，可发起、提高和维持T细胞应答，而且在适当时还提供促进限制、终止和/或消弱T细胞应答的关键负信号。CD28家族的一个成员，称为PD
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1(也称为程序化细胞死亡
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1)在活化的T细胞、B细胞和单核细胞上被增量调节；B7家族中的配体，PD
‑
L1(也称为B7H1或程序化细胞死亡
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1配体1)与T细胞上的受体PD
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1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。
[0003]已有的结果显示，肿瘤细胞中高表达的PD
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L1是通过增加T细胞的凋亡从而在肿瘤的免疫逃逸中起着重要的作用。例如，在卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌和黑色素瘤的大量样品中，在不考虑后续治疗的情况下，PD
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L1的表达与不良预后和总存活期短有关。考虑到PD
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L1在癌症发展和免疫系统调节中的重要作用，持续需要检测PD
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L1的存在情况以及阻断PD
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L1/PD
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1通路的有效抗体。因而抗PD
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L1抗体应运而生。
[0004]抗PD
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L1抗体在癌症诊疗方面具有巨大的用途。如其在晚期非小细胞肺癌的治疗中具有显著的疗效，并且在此基础上，其在小细胞肺癌、局部晚期非小细胞肺癌等多种肺癌疾病种均有着良好的运用。
[0005]其能够用于多种治疗手段，如联合化疗、靶向药物及放疗等。但是，目前抗PD
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L1抗体仍有许多的缺陷亟待解决。其中尤为突出的便如目前抗PD
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L1抗体的热稳定性差的问题。因而提高抗PD
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L1抗体的热稳定性和竞争力，是进一步拓宽抗PD
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L1抗体应用领域及提高其应用效果的关键。

技术实现思路

[0006]为解决现有的抗PD
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L1抗体的热稳定性相对较差，且多数抗PD
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L1抗体的竞争力较弱，用于治疗时效果有限等问题，本专利技术提供了一种抗PD
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L1抗体、其制备方法和应用。
[0007]本专利技术的目的在于：一、制备获得具有强竞争力的抗PD
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L1抗体；二、确保抗PD
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L1抗体具有良好的热稳定性。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案。
[0009]抗PD
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L1抗体，所述抗体由重链和轻链构成；所述重链包括以下至少一种：第一重链（4D11_huVH4），其氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有85～100 %的同一性；
第二重链（4D11_huVH5），其氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有85～100 %的同一性；第三重链（4D11_huVH6），其氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有85～100 %的同一性；所述轻链包括以下至少一种：第一轻链（4D11_huVL3），其氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有85～100 %的同一性；第二轻链（4D11_huVL4），其氨基酸序列与SEQ ID NO：5具有85～100 %的同一性。
[0010]作为优选，所述4D11_huVH4的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述4D11_huVH5的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述4D11_huVH6的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述4D11_huVL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述4D11_huVL4的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示.作为优选，所述抗体为人源化抗体。
[0011]抗PD
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L1抗体的制备方法，所述方法包括：1）构建非人源性杂交瘤细胞，从中纯化得到RNA，以纯化后的RNA逆转录为cDNA作为模板后采用特异性PCR引物对目的片段进行体外扩增，将阳性PCR产物连接T载体进行质粒的重组和转化，通过蓝白斑筛选以及PCR验证，选择阳性PCR产物克隆并测序，得到非人源性抗体原始序列；2）人源性序列构建：基于步骤1）所得的非人源性抗体原始序列，建模并经过数据库对比，将非人源性抗体原始序列突变为人源化序列；3）抗体构建：将步骤2）所得的人源化序列组合成人源化抗体；4）抗体表达：于Expi293哺乳动物表达系统中进行步骤3）所得人源化抗体的表达；5）抗体纯化：收取经步骤4）于Expi293细胞表达后的细胞上清液，纯化至抗体纯度≥90 %。
[0012]作为优选，步骤1）所述非人源性杂交瘤细胞由以下方法培养得到：1
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1）利用PD
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L1
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his抗原对小鼠进行靶蛋白免疫注射，使小鼠体内产生能分泌特异性靶蛋白抗体的B细胞；1
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2）取产生免疫反应的小鼠脾脏细胞进行细胞融合，得到融合细胞；1
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3）所得融合细胞经ELISA法检测筛选并选取能够与PD1
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hFc竞争结合PD
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L1
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his的融合细胞进行亚克隆，亚克隆后再次经过ELISA法检测筛选并选取能够与PD1
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hFc竞争结合PD
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L1
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his的融合细胞进行建株，得到非人源性杂交瘤细胞。
[0013]作为优选，步骤1）非人源性抗体原始序列包括：重链核酸序列、轻链核酸序列、重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列。
[0014]作为优选，所述重链核酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述轻链核酸序列如SEQ ID NO：7所示；
所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
[0015]作为优选，步骤2）所述人源化序列包括人源性重链序列和人源性轻链序列。
[0016]抗PD
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L1抗体的应用，所述抗PD
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L1抗体用于促进细胞上清中IFN
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γ的分泌。
[0017]作为优选，所述抗PD
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L1抗体用于制备药物和/或药物组合物；所述药物和/或药物组合物用于肿瘤和/或癌症和/或免疫性疾病和/或感染性疾病的靶向治疗。
[0018]本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种具有高特异性、强竞争活性的抗PD
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗PD
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L1抗体，其特征在于，所述抗体由重链和轻链构成；所述重链包括以下至少一种：第一重链（4D11_huVH4），其氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有85～100 %的同一性；第二重链（4D11_huVH5），其氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有85～100 %的同一性；第三重链（4D11_huVH6），其氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有85～100 %的同一性；所述轻链包括以下至少一种：第一轻链（4D11_huVL3），其氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有85～100 %的同一性；第二轻链（4D11_huVL4），其氨基酸序列与SEQ ID NO：5具有85～100 %的同一性。2.根据权利要求1所述的抗PD
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L1抗体，其特征在于，所述4D11_huVH4的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述4D11_huVH5的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述4D11_huVH6的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述4D11_huVL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述4D11_huVL4的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。3.根据权利要求1或2所述的PD
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L1抗体，其特征在于，所述抗体为人源化抗体。4.抗PD
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L1抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：1）构建非人源性杂交瘤细胞，从中纯化得到RNA，以纯化后的RNA逆转录为cDNA作为模板后采用特异性PCR引物对目的片段进行体外扩增，将阳性PCR产物连接T载体进行质粒的重组和转化，通过蓝白斑筛选以及PCR验证，选择阳性PCR产物克隆并测序，得到非人源性抗体原始序列；2）人源性序列构建：基于步骤1）所得的非人源性抗体原始序列，建模并经过数据库对比，将非人源性抗体原始序列突变为人源化序列；3）抗体构建：将步骤2）所得的人源化序列组合成人源化抗体；4）抗体表达：于Expi293哺乳动物表达系统中进行步骤3）所得人源化抗体的表达；5）抗体纯化：收取经步骤4）于Expi293细胞表达后的细胞上清液，纯化至抗体纯度≥90 %。5.根据权利要求4所述的抗PD

【专利技术属性】
技术研发人员：袁红，郭凌敏，吴彤，叶才渊，李月，毛志鹏，
申请(专利权)人：杭州美赛生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：