一种针对哺乳动物细胞的高效瞬时转染的方法技术

本发明专利技术提供一种针对哺乳动物细胞的高效瞬时转染的方法，包括以下步骤：制作哺乳动物细胞的重组质粒DNA；将PEI、重组质粒DNA和瞬时转染培养基共同进行混合得到混合培养基，其中所述瞬时转染培养基内至少含有Tween20和/或Tween80；将哺乳动物细胞培养在所述混合培养基中实现转染，所述哺乳动物细胞包括但不限于expi293/expiCHO

【技术实现步骤摘要】
一种针对哺乳动物细胞的高效瞬时转染的方法


[0001]本专利技术涉及转染领域，特别涉及一种针对哺乳动物细胞的高效瞬时转染的方法。

技术介绍

[0002]细胞转染是一种将外源性DNA、RNA或蛋白质等分子导入到靶细胞内的过程，是生命科学研究中常用的基础技术之一。目前市面上针对哺乳动物细胞的瞬时转染有以下几种技术：钙磷共沉淀法(Calcium phosphate transfection)：将DNA与钙盐混合后添加到细胞培养基中，钙离子与DNA形成复合物，进入细胞后释放DNA，这种方法易于操作、成本低廉，但转染效率和稳定性较低，有毒性和细胞损伤的风险；磷脂体介导转染法(Lipofection)：利用磷脂体载体将DNA导入到细胞内，这种方法操作简单、转染效率高，但对于不同类型的细胞有一定的限制。离子束转染法(Ion transfection)：利用高能离子束将DNA导入细胞内，可以达到较高的转染效率，但设备昂贵，操作复杂，对细胞的伤害较大。电穿孔法(Electroporation)：利用高压电场将DNA导入到细胞内，可以达到高效的转染效果，但需要特殊的设备和技术，对于一些细胞类型和特定的实验条件有一定的限制；病毒介导转染法(Virus
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mediated transfection)：利用适当的病毒作为载体将DNA导入到细胞内，这种方法效率高、稳定性好，但需要对病毒进行较严格的安全性检测和处理。也就是说，市面上的现有瞬时转染技术无法兼备成本和转染效率两个方面的因素。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种针对哺乳动物细胞的高效瞬时转染的方法，通过在细胞液中加入表达活性剂的方式，有效提高哺乳动物细胞expi293/expiCHO
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S/CHO
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K1的瞬时表达量。
[0004]为实现以上目的，本技术方案提供了一种针对哺乳动物细胞的高效瞬时转染的方法，包括以下步骤：
[0005]制作哺乳动物细胞的重组质粒DNA；
[0006]将PEI、重组质粒DNA和瞬时转染培养基共同进行混合得到混合培养基，其中所述瞬时转染培养基内至少含有Tween20和/或Tween80；
[0007]将哺乳动物细胞培养在所述混合培养基中实现转染，所述哺乳动物细胞包括但不限于expi293/expiCHO
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S/CHO
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K1。
[0008]相较于现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：本方案针对哺乳动物细胞的瞬时转染技术，在瞬时转染培养基中添加有Tween20和/或Tween80，且严格控制Tween20和/或Tween80的浓度范围，通过增加膜通过性的方式来增加细胞转染的表达量，经过实验验证本方案的细胞转染的表达量可高达600～800mg/L。
具体实施方式
[0009]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施
phosphate等，以提高外源DNA在细胞内的转染效率。
[0020]本方案提供了一种针对哺乳动物细胞的高效瞬时转染的方法，包括以下步骤：
[0021]制作哺乳动物细胞的重组质粒DNA；
[0022]将PEI、重组质粒DNA和瞬时转染培养基共同进行混合得到混合培养基，其中所述瞬时转染培养基内至少含有Tween20和/或Tween80；
[0023]将哺乳动物细胞培养在所述混合培养基中实现转染，所述哺乳动物细胞包括但不限于expi293/expiCHO
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S/CHO
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K1。
[0024]本方案的一大技术创新之处在于在瞬时转染培养基的细胞液中加入表达活性剂Tween20和/或Tween80，以增加膜通过性的方式增加PET转染复合物进入细胞的效率。
[0025]在“制作哺乳动物细胞的重组质粒DNA”步骤中，将重组基因片段克隆至质粒载体中，并加入对应哺乳动物细胞所需的调控元件得到重组质粒DNA。在本方案中，重组基因片段可以是重组蛋白也可以是抗体蛋白，所述质粒载体选择为pTT5或者pcDNA3.4。
[0026]具体的，根据实际需求选择具有哺乳动物细胞相应的启动子、选择性标记和其他调控元件的质粒载体，如pTT5或者pcDNA3.4；将重组基因片段进行PCR扩增，通过使用使用高保真酶进行PCR扩增以保证扩增效率和准确性；将扩增得到的基因片段和所选的质粒载体进行限制性内切酶切割，使它们在特定的酶切位点上发生切割，并获得具有互补末端的DNA片段；将切割后的质粒载体和基因片段进行DNA连接反应，通常采用T4 DNA连接酶进行反应，将DNA片段与载体的线性化末端连接起来；将连接后的重组质粒DNA转化至大肠杆菌中进行筛选，筛选出含有重组已经片段的克隆以得到重组质粒DNA。
[0027]在得到重组质粒DNA后再将所述重组质粒DNA转染至对应的哺乳动物细胞中，在“将PEI和重组成功的质粒DNA分别同瞬时转染培养基进行混合得到PEI培养基悬液和质粒DNA培养基悬液”步骤中，所述瞬时转染培养基含有DMEM/F12、离子、抗生素、Tween20和/或Tween80。其中DMEM/F12是一种常用的细胞培养基，含有多种必需和非必需氨基酸、维生素和矿物质等，可以提供细胞生长所需的基本营养物质；离子包括钙离子和磷酸盐等离子体系可以增强脂质体与DNA的结合和细胞摄取效率；抗生素的作用主要是为了避免细胞培养中的细菌和真菌感染。
[0028]需要特别说明的是，本方案在瞬时转染培养中加入的Tween20和/或Tween80使转染复合物更容易穿过细胞膜，提高细胞的转染效率和瞬时表达量，且可以减少转染过程中细胞损伤和细胞死亡的程度，提高转染后细胞的生存率和表达效率。
[0029]在一些实施例中，所述瞬时转染培养基中的Tween20的浓度范围为0.01％
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0.1％，优选的，浓度范围为0.02％，0.05％。这是考虑到Tween20的浓度过高可能会对细胞造成毒性和损伤，从而降低细胞的生存率和表达效率，而浓度过低又无法起到提高表达量的作用。
[0030]相同的，所述瞬时转染培养基中的Tween80的浓度范围为0.01％
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0.1％，优选的，浓度范围为0.02％，0.05％。这也是考虑到Tween80的浓度过高可能会对细胞造成毒性和损伤，从而降低细胞的生存率和表达效率，而浓度过低又无法起到提高表达量的作用。
[0031]另外，本方案将PEI、重组质粒DNA和瞬时转染培养基进行共同直接混合，这样的好处在于可以节省时间和操作步骤。
[0032]本方案针对未添加Tween80/Tween20的方案和本方案进行比对后发现，添加Tween80/Tween20之后的表达量可以从原来的200～400mg/L，提高到600～800mg/L。
[0033]本专利技术不局限于上述最佳实施方式，任何人在本专利技术的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对哺乳动物细胞的高效瞬时转染的方法，其特征在于，包括以下步骤：制作哺乳动物细胞的重组质粒DNA；将PEI、重组质粒DNA和瞬时转染培养基共同进行混合得到混合培养基，其中所述瞬时转染培养基内至少含有Tween20和/或Tween80；将哺乳动物细胞培养在所述混合培养基中实现转染，所述哺乳动物细胞包括但不限于expi293/expiCHO
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S/CHO
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K1。2.根据权利要求1所述的针对哺乳动物细胞的高效瞬时转染的方法，其特征在于，将重组基因片段克隆至质粒载体中，并加入对应哺乳动物细胞所需的调控元件得到重组质粒DNA。3.根据权利要求2所述的针对哺乳动物细胞的高效瞬时转染的方法，其特征在于，重组基因片段为重组蛋白或抗体蛋白，所述质粒载体选择为pTT5或者pcD...

【专利技术属性】
技术研发人员：王贤淼，李月，杨华丽，
申请(专利权)人：杭州美赛生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：