CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒、供体质粒以及永生化小鼠细胞系的制备方法技术

本发明专利技术公开了CRISPR/Cas9

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas9
‑
gRNA打靶质粒、供体质粒以及永生化小鼠细胞系的制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及CRISPR/Cas9
‑
gRNA打靶质粒、供体质粒以及永生化小鼠细胞系的制备方法。

技术介绍

[0002]小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)属于成体干细胞，具有自我更新和分化为多种类型细胞的潜能和响应细胞损伤的信号分子(称为归巢信号，如趋化因子、生长因子和黏附分子等)向损伤区域移动的迁移特性。在一定条件下，BMSCs在体内和体外可分化为多种细胞以及骨、软骨以及脂肪等组织，发挥免疫调节、分泌营养因子等功能，促进受损组织的修复和再生，为基于MSC治疗的疾病带来希望。
[0003]BMSC属于原代细胞，增殖周期有限，体外传代不能超过10代，这种特性限制了基于BMSC的相关研究和治疗的能力。有研究显示，细胞引入SV40 large T antigen基因，可以在不影响细胞其他特定功能的同时，使细胞永生化。通过慢病毒感染或转染法使永生化基因随机敲入到原代细胞，可能会影响到其他基因的表达。CRISPR Cas9技术是一种基因编辑技术，可用于体内体外定点敲除、敲入或突变基因，用于原代细胞敲入SV40 large T antigen基因时存在以下缺点：1)制备原代小鼠骨髓间充质干细胞时，已有的骨片迁移法从小鼠长骨分离骨髓间充质干细胞时，细胞容易被污染；2)Donor载体质粒构建步骤繁琐；3)基于慢病毒系统把打靶质粒引入细胞，由于脱靶效应，可能会影响其他基因；4)在抗生素筛选细胞后，没有进行干细胞分选，增加了后续筛选鉴定单克隆细胞的工作量。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供CRISPR/Cas9
‑
gRNA打靶质粒、供体质粒以及永生化小鼠细胞系的制备方法。CRISPR Cas9技术是一种基因编辑技术，可用于体内体外定点敲除、敲入或突变基因。本专利技术基于CRISPR Cas9基因编辑技术制备具有永生化特性细胞系，为基础研究及临床应用提供了便利。
[0005]具体技术方案如下：
[0006]本专利技术第一方面提供一种小鼠Rosa26基因的CRISPR/Cas9
‑
gRNA打靶质粒，所述打靶质粒包括靶向小鼠Rosa26基因的sgRNA序列对sgRNA
‑
F和sgRNA
‑
R，所述sgRNA
‑
F和sgRNA
‑
R的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA序列对构建至骨架载体中。
[0007]进一步地，所述骨架载体为lentiCRISPRv2。
[0008]本专利技术第二方面提供一种表达外源基因的供体质粒，所述供体质粒包含骨架载体以及自5
’
端至3
’
端顺次连接的左同源臂、EF1α启动子、外源基因、Myc标签、SV40poly(A)信号序列、SV40启动子、NeoR/KanR抗性基因、SV40poly(A)信号序列和右同源臂；
[0009]所述左同源臂的序列如SEQ ID NO.12所示；
[0010]所述右同源臂的序列如SEQ ID NO.15所示；
[0011]优选地，所述骨架载体为pUC19。
[0012]进一步地，所述外源基因为SV40大T抗原基因。
[0013]进一步地，所述供体质粒的构建方法包括：
[0014]1)利用限制性内切酶BamHI和Hind III酶切pUC19质粒，得到线性化的pUC19 DNA片段，记为DNA片段II；
[0015]2)以小鼠基因组DNA为模板，以Left arm
‑
F和Left arm
‑
R为引物，PCR扩增获得左同源臂，记为DNA片段III；所述Left arm
‑
F的序列如SEQ ID NO.3所示，所述Left arm
‑
R的序列如SEQ ID NO.4所示；
[0016]3)以FUGW
‑
EF1α
‑
SV40LT(HygR)质粒为模板，以SV40LT
‑
F和SV40LT
‑
R为引物，PCR扩增获得EF1α
‑
SV40大T抗原基因
‑
Myc标签
‑
SV40 poly(A)信号序列，记为DNA片段IV；所述SV40LT
‑
F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述SV40LT
‑
R的序列如SEQ ID NO.6所示；
[0017]4)以pcDNA3.1(+)质粒为模板，以NeoR/KanR
‑
F和NeoR/KanR
‑
R为引物，PCR扩增获得SV40
‑
NeoR/KanR抗性基因
‑
SV40poly(A)信号序列，记为DNA片段V；所述NeoR/KanR
‑
F的序列如SEQ ID NO.7所示，所述NeoR/KanR
‑
R的序列如SEQ ID NO.8所示；
[0018]5)以小鼠基因组DNA为模板，以Right arm
‑
F和Right arm
‑
R为引物，PCR扩增获得右同源臂，记为DNA片段
Ⅵ
；所述Right arm
‑
F的序列如SEQ ID NO.9所示，所述Right arm
‑
R的序列如SEQ ID NO.10所示；
[0019]6)连接上述DNA片段Ⅳ、
Ⅴ
和
Ⅵ
，获得EF1α
‑
SV40大T抗原基因
‑
Myc标签
‑
SV40 poly(A)信号序列
‑
SV40
‑
NeoR/KanR抗性基因
‑
SV40poly(A)信号序列
‑
右同源臂，记为DNA片段
Ⅶ
；
[0020]7)以步骤6)所得DNA片段
Ⅶ
为模板，以SV40LT
‑
F和Right arm
‑
R为引物，PCR扩增，获得大量DNA片段
Ⅶ
；所述SV40LT
‑
F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述Right arm
‑
R的序列如SEQ ID NO.10所示；
[0021]8)连接步骤7)所得DNA片段
Ⅶ
与DNA片段Ⅲ、Ⅱ，即获得供体质粒。
[0022]本专利技术第三方面提供一种用于在小鼠Rosa26位点定点敲入外源基因的CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9系统包含所述的CRISPR/Cas本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠Rosa26基因的CRISPR/Cas9
‑
gRNA打靶质粒，其特征在于，所述打靶质粒包括靶向小鼠Rosa26基因的sgRNA序列对sgRNA
‑
F和sgRNA
‑
R，所述sgRNA
‑
F和sgRNA
‑
R的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA序列对构建至骨架载体中。2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9
‑
gRNA打靶质粒，其特征在于，所述骨架载体为lentiCRISPRv2。3.一种表达外源基因的供体质粒，其特征在于，所述供体质粒包含骨架载体以及自5
’
端至3
’
端顺次连接的左同源臂、EF1α启动子、外源基因、Myc标签、SV40 poly(A)信号序列、SV40启动子、NeoR/KanR抗性基因、SV40 poly(A)信号序列和右同源臂；所述左同源臂的序列如SEQ ID NO.12所示；所述右同源臂的序列如SEQ ID NO.15所示；优选地，所述骨架载体为pUC19。4.根据权利要求3所述的供体质粒，其特征在于，所述外源基因为SV40大T抗原基因。5.根据权利要求4所述的供体质粒，其特征在于，所述供体质粒的构建方法包括：1)利用限制性内切酶BamHI和Hind III酶切pUC19质粒，得到线性化的pUC19 DNA片段，记为DNA片段II；2)以小鼠基因组DNA为模板，以Left arm
‑
F和Left arm
‑
R为引物，PCR扩增获得左同源臂，记为DNA片段III；所述Left arm
‑
F的序列如SEQ ID NO.3所示，所述Left arm
‑
R的序列如SEQ ID NO.4所示；3)以FUGW
‑
EF1α
‑
SV40LT(HygR)质粒为模板，以SV40LT
‑
F和SV40LT
‑
R为引物，PCR扩增获得EF1α
‑
SV40大T抗原基因
‑
Myc标签
‑
SV40 poly(A)信号序列，记为DNA片段IV；所述SV40LT
‑
F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述SV40LT
‑
R的序列如SEQ ID NO.6所示；4)以pcDNA3.1(+)质粒为模板，以NeoR/KanR
‑
F和NeoR/KanR
‑
R为引物，PCR扩增获得SV40
‑
NeoR/KanR抗性基因
‑
SV40 poly(A)信号序列，记为DNA片段V；所述NeoR/KanR
‑
F的序列如SEQ ID NO.7所示，所述NeoR/KanR
‑
R的序列如SEQ ID NO.8所示；5)以小鼠基因组DNA为模板，以Right arm
‑
F和Right arm
‑
R为引物，PCR扩增获得右同源臂，记为DNA片段
Ⅵ
；所述Right arm
‑
F的序列如SEQ ID NO.9所示，所述Right arm
‑
R的序列如SEQ ID NO.10所示；6)连接上述DNA片段Ⅳ、
Ⅴ
和
Ⅵ
，获得EF1α
‑
SV40大T抗原基因
‑
Myc标签

【专利技术属性】
技术研发人员：陈亮，冯薛佳，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：