本发明专利技术公开了一种特异性清除线粒体基因组的方法，所述方法包括通过基因编辑技术特异性清除生物样本中的线粒体基因组(mtDNA)，所述生物样本为细胞、动物胚胎、动物成体、类器官、动物体或人体，本发明专利技术使用基因编辑技术例如CRISPR/GeoCas9基因编辑技术对线粒体基因组(mtDNA)进行特异性清除，GeoCas9蛋白在50℃下具有较好的切割效率，并且能够特异性清除生物样本中的线粒体基因组(mtDNA)。物样本中的线粒体基因组(mtDNA)。
【技术实现步骤摘要】
特异性清除线粒体基因组(mtDNA)的方法
[0001]本专利技术涉及基因编辑
，尤其涉及一种特异性清除线粒体基因组(mtDNA)的方法以及GeoCas9的用途。
技术介绍
[0002]线粒体是人体中的重要能量工厂，为细胞提供生存必须的能量，并参与到众多细胞功能中。线粒体DNA为环状DNA，存在于线粒体双层脂膜内部，并于此复制、转录，是人类基因组中唯一存在于细胞核以外的组分，其上共有37个基因用以维持线粒体最基本的功能需求。单一细胞内可以同时存在数十至数千个，甚至上万个mtDNA，以此维持庞大的功能网络的需求。mtDNA的突变、缺失及插入可以引起细胞的功能异常，并引发多种疾病。病灶多见于须要大量能量供应的组织、器官中，如脑、神经系统、心脏、肌肉等。
[0003]线粒体疾病发生于各个年龄段，而且较多在婴幼儿和青少年时期被发现、诊断。由于mtDNA遗传并不符合经典的孟德尔遗传学，即mtDNA上的基因并不存在纯合、杂合，因此mtDNA突变率往往仅需要在特异组织中达到一个特定的阈值，就可以引发功能异常，进而引发疾病。近年来有越来越多的证据显示mtDNA突变与神经退行性疾病、癌症、脑卒中等疾病相关。
[0004]针对mtDNA突变的清除与纠正是潜在的治疗方案，近年来也有相关的报道。基于ZFN、TALEn技术而开发的mtDNA编辑技术已经被多个实验室报道。此外使用线粒体定位的限制性内切酶的策略也有少数报道。利用CRISPR技术的线粒体基因组编辑虽然有被报道，但仍然有很多核心问题没有被回答。
专利技术内容
[0005]为了解决上述的技术问题，本专利技术提供了一种特异性清除线粒体基因组(mtDNA)的方法，其是通过基因编辑技术例如CRISPR/GeoCas9基因编辑技术特异性清除生物样本中的线粒体基因组(mtDNA)。
[0006]本专利技术具体技术方案如下：
[0007]1.一种特异性清除线粒体基因组(mtDNA)的方法，包括：
[0008]通过基因编辑技术特异性清除生物样本中的线粒体基因组(mtDNA)，所述生物样本为细胞、动物胚胎、动物成体、类器官、动物体或人体。
[0009]2.根据项1所述的方法，其中，所述基因编辑技术为CRISPR/GeoCas9基因编辑技术。
[0010]3.根据项2所述的方法，其中，将sgRNA导入所述线粒体中以实现对线粒体基因组(mtDNA)的编辑，优选所述sgRNA具有引导元件，所述引导元件选自RPPH1、RP、FD，进一步优选所述引导元件为RP，优选RP的序列为SEQ ID NO:42所示。
[0011]4.根据项3所述的方法，其中，含有引导元件RP的sgRNA的序列如SEQ ID NO：40或41所示。
[0012]5.根据项3或4所述的方法，其中，将sgRNA与GeoCas9编码核苷酸共同递送至含有线粒体基因组(mtDNA)的细胞中。
[0013]6.根据项2
‑
5中任一项所述的方法，其中，所述GeoCas9是具有线粒体靶向序列(MTS)的GeoCas9，优选所述GeoCas9包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列，优选的，所述GeoCas9包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0014]7.一种通过CRISPR/GeoCas9基因编辑技术特异性清除线粒体基因组(mtDNA)的方法，包括将含有SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:41所示的sgRNA导入所述线粒体基因组内。
[0015]8.根据项7所述的方法，其中，将所述sgRNA和GeoCas9编码核苷酸共同递送至含有线粒体基因组(mtDNA)的生物样本中，所述生物样本为细胞、动物胚胎、动物成体、类器官、动物体或人体。
[0016]9.GeoCas9在制备治疗与线粒体功能障碍相关的疾病的药物中的用途。
[0017]10.根据项9所述的用途，其中，与线粒体功能障碍相关的疾病为线粒体肌病、糖尿病和耳聋(DAD)、莱伯遗传性视神经病(LHON)、Leigh综合征、神经病、共济失调、视网膜色素变性和眼脸下垂(NARP)、伴有破损性红肌纤维病的肌阵挛型癫病(MERRF)、肌肉神经源性胃肠脑病(MNGIE)、线粒体肌病、脑肌病、乳酸酸中毒、中风样综合征(MELAS)、Kearns Sayre综合征(KSS)、进行性眼外肌麻痹(PEO)、皮尔逊氏综合征、母体遗传性肌病和心肌病(MIMyCA)、凯氏视神经病变、遗传性痉挛性截瘫、腓骨肌萎缩症、散发性年龄相关神经退行性疾病、帕金森氏病(PD)、阿尔茨海默氏病(AD)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、青光眼、家族性神经退行性疾病、家族性PD、家族性AD、亨廷顿氏病、色素性视网膜炎(RP)、斯塔加特氏病、慢性进行性外眼肌麻痹(CPEO)和/或mtDNA突变、插入、缺失造成的先天性或后天性疾病。
[0018]11.根据项9或10所述的用途，其中，所述GeoCas9是具有线粒体靶向序列(MTS)的GeoCas9，优选所述GeoCas9包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列，优选的，所述GeoCas9包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0019]12.GeoCas9在制备治疗下述疾病的药物中的用途：线粒体肌病、糖尿病和耳聋(DAD)、莱伯遗传性视神经病(LHON)、Leigh综合征、神经病、共济失调、视网膜色素变性和眼脸下垂(NARP)、伴有破损性红肌纤维病的肌阵挛型癫病(MERRF)、肌肉神经源性胃肠脑病(MNGIE)、线粒体肌病、脑肌病、乳酸酸中毒、中风样综合征(MELAS)、Kearns Sayre综合征(KSS)、进行性眼外肌麻痹(PEO)、皮尔逊氏综合征、母体遗传性肌病和心肌病(MIMyCA)、凯氏视神经病变、遗传性痉挛性截瘫、腓骨肌萎缩症、散发性年龄相关神经退行性疾病、帕金森氏病(PD)、阿尔茨海默氏病(AD)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、青光眼、家族性神经退行性疾病、家族性PD、家族性AD、亨廷顿氏病、色素性视网膜炎(RP)、斯塔加特氏病、慢性进行性外眼肌麻痹(CPEO)和/或mtDNA突变、插入、缺失造成的先天性或后天性疾病。
[0020]13.根据项12所述的用途，其中，所述GeoCas9是具有线粒体靶向序列(MTS)的GeoCas9，优选所述GeoCas9包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列，优选的，所述GeoCas9包含SEQ ID NO:2
所示的氨基酸序列。
[0021]14.一种组合物，其包含sgRNA和GeoCas9编码核苷酸，所述sgRNA具有引导元件。
[0022]15.根据项14所述的组合物，其中，所述引导元件选自R本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种特异性清除线粒体基因组(mtDNA)的方法，包括：通过基因编辑技术特异性清除生物样本中的线粒体基因组(mtDNA)，所述生物样本为细胞、动物胚胎、动物成体、类器官、动物体或人体。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基因编辑技术为CRISPR/GeoCas9基因编辑技术。3.根据权利要求2所述的方法，其中，将sgRNA导入所述线粒体中以实现对线粒体基因组(mtDNA)的编辑，优选所述sgRNA具有引导元件，所述引导元件选自RPPH1、RP、FD，进一步优选所述引导元件为RP，优选RP的序列为SEQ ID NO:42所示；优选的，含有引导元件RP的sgRNA的序列如SEQ ID NO：40或41所示；优选的，将sgRNA与GeoCas9编码核苷酸共同递送至含有线粒体基因组(mtDNA)的生物样本中；所述GeoCas9是具有线粒体靶向序列(MTS)的GeoCas9，优选所述GeoCas9包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列，优选的，所述GeoCas9包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。4.一种通过CRISPR/GeoCas9基因编辑技术特异性清除线粒体基因组(mtDNA)的方法，包括将含有SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:41所示的sgRNA导入所述线粒体基因组内。5.根据权利要求4所述的方法，其中，将所述sgRNA和GeoCas9编码核苷酸共同递送至含有线粒体基因组(mtDNA)的生物样本中，所述生物样本为细胞、动物胚胎、动物成体、类器官、动物体或人体。6.GeoCas9在制备治疗与线粒体功能障碍相关的疾病的药物中的用途。7.根据权利要求6所述的用途，其中，与线粒体功能障碍相关的疾病为线粒体肌病、糖尿病和耳聋(DAD)、莱伯遗传性视神经病(LHON)、Leigh综合征、神经病、共济失调、视网膜色素变性和眼脸下垂(NARP)、伴有破损性红肌纤维病的肌阵挛型癫病(MERRF)、肌肉神经源性胃肠脑病(MNGIE)、线粒体肌病、脑肌病、乳酸酸中毒、中风样综合征(MELAS)、Kearns Sayre综合征(KSS)、进行性眼外肌麻痹(PEO)、皮尔逊氏综合征、母体遗传性肌病和心肌病(MIMyCA)、凯氏视神经病变、遗传性痉挛性截瘫、腓骨肌萎缩症、散发性年龄相关神经退行性疾病、帕金森氏病(PD)、阿尔茨海默氏病(AD)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、青光眼、家族性神经退行性疾病、家族性PD、家族性AD、亨廷顿氏病、色素性视网膜炎(RP)、斯塔加特氏...
【专利技术属性】
技术研发人员：李卓，吴景淳，
申请(专利权)人：李卓，
类型：发明
国别省市：
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