一种稳定表达青色荧光蛋白的黑色素瘤细胞株的构建方法及应用技术

本公开提供了一种稳定表达青色荧光蛋白的黑色素瘤细胞株的构建方法及应用，所述方法包括：构建用于表达青色荧光蛋白mCerulean的PB载体质粒，得到PB

【技术实现步骤摘要】
一种稳定表达青色荧光蛋白的黑色素瘤细胞株的构建方法及应用


[0001]本公开涉及肿瘤免疫和光学成像领域，尤其涉及一种稳定表达青色荧光蛋白的黑色素瘤细胞株的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]近年来，肿瘤免疫治疗已经成为癌症治疗研究中最为热门的领域，随着对肿瘤特征的不断深入认识，免疫治疗从传统的以肿瘤细胞为中心的治疗转变为考虑肿瘤微环境整体的治疗方式，肿瘤微环境得到高度的重视。肿瘤微环境的异质性和免疫治疗疗效之间存在一定关联，通过对肿瘤免疫微环境内免疫细胞和分子进行长时程动态观察，可以更好为免疫治疗提供指导。因此，在肿瘤免疫清除免疫过程中，肿瘤微环境中先后发生了哪些免疫学细胞分子事件，目前所知甚少，活体光学成像技术是实现可视化肿瘤微环境的免疫学动态事件的首选技术。
[0003]多种荧光蛋白报告基因的出现为光学显微成像提供了十分有力的工具，绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)灵敏度高，在450
‑
490nm蓝光激发下可产生较强的荧光信号。相比于GFP，红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein，RFP)，它有更高的荧光强度，成像背景低，具有更长激发和发射波长。鉴于这两类荧光蛋白的良好特性，在研究肿瘤免疫领域中，构建转基因荧光小鼠时，GFP和RFP常作为首选。(例如：经常会用到GFP
‑
CXCR6
‑
T细胞、mRFP
‑
Treg免疫细胞的转基因小鼠)，因此，在建立多种颜色标记的肿瘤微环境小鼠模型时，限制了对肿瘤细胞标记的荧光蛋白的选择。因此，迫切需要其它合适激发波长的荧光蛋白来实现对肿瘤细胞的标记。

技术实现思路

[0004]本公开提供了一种稳定表达青色荧光蛋白的黑色素瘤细胞株的构建方法及应用，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。
[0005]根据本公开的第一方面，提供了一种稳定表达青色荧光蛋白的黑色素瘤细胞株的构建方法，所述方法包括：
[0006]构建用于表达青色荧光蛋白mCerulean的PB载体质粒，得到PB
‑
CFP质粒；
[0007]将所述PB
‑
CFP质粒和PBase辅助质粒共转染到B16肿瘤细胞中，以获得表达青色荧光蛋白mCerulean的细胞株；
[0008]培养转染后的B16肿瘤细胞，通过筛选单克隆细胞株获取多株稳定表达青色荧光蛋白mCerulean的CFP
‑
B16细胞株。
[0009]在一可实施方式中，所述构建用于表达青色荧光蛋白mCerulean的PB载体质粒，得到PB
‑
CFP质粒，包括：
[0010]使用限制性内切酶切开PB载体，使PB载体线性化；
[0011]将青色荧光蛋白mCerulean构建到PB载体上，获取PB
‑
CFP质粒。
[0012]在一可实施方式中，扩增青色荧光蛋白mCerulean片段，扩增引物为：
[0013]正向引物：tgtctcatcattttggcaaagcttaagcatggtgagcaaggg；
[0014]反向引物：gaggagtgaatttcgaattcgtttaaacttacttgtacagc。
[0015]在一可实施方式中，所述通过筛选单克隆细胞株获取多株稳定表达青色荧光蛋白mCerulean的CFP
‑
B16细胞株，包括：
[0016]对转染后的B16肿瘤细胞进行消化，流式分选出表达青色荧光蛋白mCerulean的阳性细胞，并将所述阳性细胞稀释到新的孔板中培养；
[0017]再筛选出稳定表达青色荧光蛋白mCerulean的单克隆细胞团，再将所述稳定表达青色荧光蛋白mCerulean的单克隆细胞团消化稀释至新的孔板中培养；
[0018]重复操作，直到筛选出100％稳定表达青色荧光蛋白mCerulean的细胞株团。
[0019]在一可实施方式中，将筛选的CFP
‑
B16肿瘤细胞通过共聚焦荧光成像，确定其发光率在95％以上。
[0020]根据本公开的第二方面，提供了一种稳定表达青色荧光蛋白的黑色素瘤细胞株的应用，将稳定表达青色荧光蛋白的黑色素瘤细胞株CFP
‑
B16肿瘤细胞接种在免疫系统正常的活体小鼠上，通过活体光学成像可视化观察CFP
‑
B16肿瘤免疫清除过程中的发生的免疫学细胞事件。
[0021]在一可实施方式中，一种稳定表达青色荧光蛋白的黑色素瘤细胞株的应用，建立全身细胞标记GFP的转基因小鼠皮窗模型，皮窗内接种CFP
‑
B16细胞株，活体大视野连续多天成像，直观展示CFP
‑
B16
regression
发生的肿瘤自发性消退现象。
[0022]在一可实施方式中，一种稳定表达青色荧光蛋白的黑色素瘤细胞株的应用，建立CXCR6
‑
GFP的转基因小鼠皮窗模型，皮窗内接种CFP
‑
B16细胞株，长时程活体光学成像动态观察肿瘤清除过程中对内源性T细胞的募集情况，实现对肿瘤微环境内免疫细胞的运动行为的长时程监测。
[0023]本专利技术提供了一种稳定表达青色荧光蛋白(mCerulean)的黑色素肿瘤细胞(B16)构建方法及应用，通过构建用于表达青色荧光蛋白mCerulean的PB载体质粒，得到PB
‑
CFP质粒；将所述PB
‑
CFP质粒和PBase辅助质粒共转染到B16肿瘤细胞中，以获得表达青色荧光蛋白mCerulean的细胞株；培养转染后的B16肿瘤细胞，通过筛选单克隆细胞株获取多株稳定表达青色荧光蛋白mCerulean的CFP
‑
B16细胞株。将CFP
‑
B16肿瘤细胞接种在免疫系统正常的小鼠上，可发生自发性免疫清除现象，进一步活体光学成像能够可视化观察到CFP
‑
B16肿瘤免疫清除过程中的发生的免疫学细胞事件。本专利技术提出的构建CFP
‑
B16
regression
细胞株的方法，为能够建立多色标记的肿瘤微环境奠定基础，为解析肿瘤微环境内复杂的肿瘤细胞和免疫细胞之间的动态信息交流的免疫学机制提供手段。
[0024]应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。
附图说明
[0025]通过参考附图阅读下文的详细描述，本公开示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本公开的若干实施方式，其中：
[0026]在附图中，相同或对应的标号表示相同或对应的部分。
[0027]图1示出了本公开实施例一种稳定表达青色荧光蛋白的黑色素瘤细胞株的构本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定表达青色荧光蛋白的黑色素瘤细胞株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：构建用于表达青色荧光蛋白mCerulean的PB载体质粒，得到PB
‑
CFP质粒；将所述PB
‑
CFP质粒和PBase辅助质粒共转染到B16肿瘤细胞中，以获得表达青色荧光蛋白mCerulean的细胞株；培养转染后的B16肿瘤细胞，通过筛选单克隆细胞株获取多株稳定表达青色荧光蛋白mCerulean的CFP
‑
B16细胞株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建用于表达青色荧光蛋白mCerulean的PB载体质粒，得到PB
‑
CFP质粒，包括：使用限制性内切酶切开PB载体，使PB载体线性化；将青色荧光蛋白mCerulean构建到PB载体上，获取PB
‑
CFP质粒。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，扩增青色荧光蛋白mCerulean片段，扩增引物为：正向引物：tgtctcatcattttggcaaagcttaagcatggtgagcaaggg；反向引物：gaggagtgaatttcgaattcgtttaaacttacttgtacagc。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通过筛选单克隆细胞株获取多株稳定表达青色荧光蛋白mCerulean的CFP
‑
B16细胞株，包括：对转染后的B16肿瘤细胞进行消化，流式分选出表达青色荧光蛋白mCerulean的阳性细胞，并将所述阳性细胞稀释到新的孔板中培养；再筛选出稳定表达青色荧光蛋白mCerulean的单克...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁淑红，张杰，张智红，
申请(专利权)人：海南大学三亚研究院，
类型：发明
国别省市：