抗人PD1全人源抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗人PD1全人源抗体及其应用，所述抗人PD1全人源抗体包括三个重链可变区HCDR和三个轻链可变区LCDR；所述三个重链可变区包括：HCDR1为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，HCDR2为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，HCDR3为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述三个轻链可变区包括：LCDR1为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，LCDR2为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，LCDR3为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。本发明专利技术降低了免疫原性，同时亲和力成熟，活性有极大的提升。有极大的提升。有极大的提升。

【技术实现步骤摘要】
抗人PD1全人源抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种抗人PD1全人源抗体及其应用。

技术介绍

[0002]肿瘤生长微环境的形成，不仅依赖其自身分泌的一些细胞因子，还能够通过某些信号通路，逃避免疫监视及调控，从而使机体对肿瘤细胞的免疫耐受，进而导致肿瘤的快速进展。
[0003]PD1为免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，为CD28超家族成员和治疗性抗体，是一种免疫抑制分子，其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来，由日本京都大学本庶佑教授1992年发现。PD1蛋白在活化的T细胞，B细胞等都有表达。相较于CD28超家族其他成员，PD1表达更具广泛性，就此而言，似可说明其在免疫应答中的作用比CD28超家族其他成员复杂。PD1分子最显著的特征是细胞质区的尾部含有两个酪氨酸残基，分别参与组成免疫受体酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor tyrosine
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based inhibitory motifs，ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(Immunoreceptor tyrosine
‑
based switch motifs，ITSM)结构域。ITIM能使细胞质段的磷酸化得到恢复，发挥拮抗抗原受体的功能，而ITSM上的酪氨酸残基在PD1的负性调节中是必需的。
[0004]之前的PD1抗体(包括已上市的keytruda等药物)均是以杂交瘤人源化的抗体为主，活性低，基本没有全人源的PD1抗体。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种抗人PD1全人源抗体。
[0006]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种抗人PD1全人源抗体，其特征在于，其包括三个重链可变区HCDR和三个轻链可变区LCDR；所述三个重链可变区包括：HCDR1为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，HCDR2为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，HCDR3为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述三个轻链可变区包括：LCDR1为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，LCDR2为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，LCDR3为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
[0008]第二方面，本专利技术提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的抗人PD1全人源抗体。
[0009]第三方面，本专利技术提供一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有第二方面所述的核酸分子。
[0010]第四方面，本专利技术提供一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有至少一个拷贝的第三方面所述的表达载体。
[0011]第五方面，本专利技术提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括第一方面所述的抗人PD1全人源抗体，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
[0012]第六方面，本专利技术提供第一方面所述的抗人PD1全人源抗体、第四方面所述的宿主
细胞或第五方面所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合在制备用于预防、减轻、改善或抑制疾病或病症的药物中的用途。
[0013]优选地，所述疾病或病症选自：癌症和/或自身免疫性疾病。
[0014]本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术降低了免疫原性，同时亲和力成熟，活性有极大的提升。
附图说明
[0015]图1为本专利技术His tag抗原检测panning输出集合示意图。
[0016]图2为本专利技术候选分子上清排序示意图。
[0017]图3为本专利技术SDS
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PAGE蛋白纯度鉴定示意图。
[0018]图4为本专利技术筛选分子典型SEC
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HPLC图谱示意图。
[0019]图5为本专利技术ELISA测定抗体与抗原结合活性示意图。
[0020]图6为本专利技术FACS测定抗体与细胞结合活性示意图。
[0021]图7为本专利技术FACS测定抗体竞争活性示意图。
[0022]图8为本专利技术化学发光实验的结果示意图。
具体实施方式
[0023]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0024]本专利技术抗人PD1全人源抗体的制备方法包括以下步骤：构建人抗体的基因文库：取Ficoll
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Paque密度梯度分离液(购自GE公司，目录号：17144003S)15mL缓缓加入50mL离心管中。将离心管倾斜并分批次沿管壁缓慢加入15mL采集的正常人血液，使Ficoll
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Paque密度梯度分离液与正常人血液保持清晰的分离界面。将装有所述血液和分离液的50mL离心管于15℃左右离心20min，其中将离心机设置为400g，加速度为3，减速为0的参数。离心之后，整个液面分为四层，上层为血浆混合物，下层为红细胞和粒细胞，中层为Ficoll
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Paque液体，在上、中层交界处有以PBMC为主的白色云雾层狭窄带，即PBMC细胞层。用无菌巴氏吸管小心地吸去上层的血浆混合物，然后再用新的无菌巴氏吸管吸取PBMC，获得分离的PBMC。将分离的PBMC先用PBS润洗两遍，再在4℃下以1500rpm的转速离心10min，最后用1.5mL的PBS重悬，并通过细胞计数仪(CountStar，CountStar Altair)计数。通过常规方法自分离的PBMC细胞提取总RNA。使用反转录试剂盒(购自TaKaRa公司,目录号：6210A)将提取的总RNA反转录成cDNA。基于重链和轻链种系基因的序列相似度，分别在重链和轻链的V区前端和第一个恒定区后端设计简并引物，PCR后得到抗体的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片段。回收抗体的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片段后，通过融合PCR方法扩增得到含有抗体的轻重链可变区的片段，接着对该PCR产物和噬菌体展示用载体进行酶切、回收和连接，连接产物通过回收试剂盒(Omega，目录号：D6492
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02)回收。最后，通过电转仪(Bio
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Rad，MicroPulser)转化至感受态大肠杆菌SS320(Lucigen，MC1061 F)中，并将经转化的大肠杆菌SS320菌液涂布于具有氨苄青霉素抗性的2
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YT固体平板(固体平板由1.5％的胰蛋白胨，1％的酵母提取物，0.5％的NaCl，1.5％的琼脂，按质量体积g/mL配制而成)。
[0025]本专利技术使用生物素化PD
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Fc融合蛋白筛选全人源抗体噬菌体展示库，以获得特
异性结合人PD
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1的展示在噬菌体上的抗PD
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1Fab抗体片段。本专利技术采用的具体筛选方法如下：采用磁珠法进行抗体库的筛选，在使用生物素化PD
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Fc融合蛋白对全人源抗体噬菌体展示库进行每一轮淘选之前本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗人PD1全人源抗体，其特征在于，其包括三个重链可变区HCDR和三个轻链可变区LCDR；所述三个重链可变区包括：HCDR1为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，HCDR2为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，HCDR3为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述三个轻链可变区包括：LCDR1为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，LCDR2为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，LCDR3为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的抗人PD1全人源抗体。3.一种表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁红，郭凌敏，徐永凤，李月，叶才渊，丁慧，
申请(专利权)人：杭州美赛生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：