一种硒代甲硫氨酸标记的HisD蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白及其制备方法，通过对完全培养基的成分进行优化改良使得细菌可以利用游离的硒代甲硫氨酸改变表达蛋白，再引入IPTG和锌离子使大肠杆菌表达目的蛋白，以得到硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白。D蛋白。D蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白及其制备方法


[0001]本专利技术涉及蛋白制备领域，特别涉及一种硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白及其制备方法。

技术介绍

[0002]His D蛋白是一种由组织特异性抗原(TSA)基因编码的蛋白质，这种蛋白质被发现在许多不同类型的细胞中，包括肿瘤细胞、肝细胞和肠道细胞，其名称中的“His D”是指蛋白质序列中的一段特定氨基酸序列，可以在肿瘤细胞和其他细胞中被识别为一种肿瘤相关抗原，从而成为癌症诊断和治疗的潜在靶点。
[0003]硒已经确认为人体必需微量元素，但科学研究结果表明，硒是非常有前景抗肿瘤元素。与无机硒相比，有机硒毒性低，生物利用度高，药理活性强，硒代甲硫氨酸是一种含有硒的氨基酸，其化学式为SeCH2CH(NH2)COOH。它是蛋白质中的一种非常罕见的氨基酸，只有少数蛋白质中含有硒代甲硫氨酸，例如甲硫氨酸
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富含蛋白质(selenoprotein P)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase)。硒代甲硫氨酸在生物体内扮演着重要的角色。例如，谷胱甘肽过氧化物酶中的硒代甲硫氨酸可以帮助减少细胞内的有害氧化物质。另外，硒代甲硫氨酸还与免疫系统的正常功能、神经系统的发育和功能以及生殖健康等方面有关。由于硒代甲硫氨酸的重要性，一些研究人员正在探索其在治疗某些疾病方面的潜在用途。此外，在结晶学中常运用MAD(Multi
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wavelength anomalous dispersion，多波长反常散射)推定相位。和硫原子相比，重原子硒的反常散射信号更加清晰，因此用硒代蛋氨酸标记蛋白在MAD解析相位实验中运用越来越广泛。硒的化学性质和硫非常接近；其次，硒代蛋氨酸能完全代替蛋氨酸而不改变被取代蛋白的性质；再者，大部分硒代蛋氨酸取代蛋氨酸的蛋白晶体与相应的天然蛋白晶体是同形晶体。
[0004]而如前所述，自然界中只有少数蛋白质是自带硒代甲硫氨酸，故市面上需要自行制备硒代甲硫氨酸标记的蛋白质，现有技术制备硒代甲硫氨酸标记的蛋白的主要方式是利用大肠杆菌表达系统。一般来说，将含有硒代甲硫氨酸的培养基加入到大肠杆菌培养基中，让大肠杆菌在其中生长并表达蛋白质，此时硒代甲硫氨酸会被替换到蛋白质中的甲硫氨酸(methionine)的位置上，从而得到含有硒代甲硫氨酸标记的蛋白质，但是这种方式需要严格控制培养条件，以保证蛋白质的质量和纯度，且也需要对硒代甲硫氨酸的使用量进行严格的控制以避免对蛋白质造成不可逆的影响，另外，目前大部分商品化L
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硒代蛋氨酸的培养基价钱高，使得大规模表达使用成本高。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白及其制备方法，通过对完全培养基的成分进行优化改良使得细菌可以利用游离的硒代甲硫氨酸改变表达蛋白，再引入IPTG和锌离子使大肠杆菌表达目的蛋白，以得到硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白。
[0006]为实现以上目的，本方案提供了硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白的制备方法，包括
以下步骤：
[0007]将含有His D基因的质粒转化到大肠杆菌的BL21感受态中，并置于LB培养基中过夜培养挑选出阳性克隆；
[0008]将阳性克隆接入完全培养基中置于常温环境下的摇床进行培养使得阳性克隆标记上硒代蛋氨酸，其中所述完全培养基的成分包括40X可溶氨基酸混合物、100X不可溶氨基酸混合物、10X缓冲液A、40％葡萄糖、金属盐溶液、抗生素以及维生素B1
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硒代甲硫氨酸混合物；
[0009]加入异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷和锌离子诱导过夜，离心去上清液后用重悬Buffer A重悬菌体并进行纯化得到硒代蛋氨酸标记的His D蛋白。
[0010]相较于现有技术，本方案具有以下特点和有益效果：
[0011]本方案对完全培养基进行了优化改良，完全培养基内含有多种氨基酸、L
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硒代蛋氨酸，葡萄糖，维生素，金属盐等成分，这些成分使得重组His D的大肠杆菌可以标记上硒代蛋氨酸，进而制备得到硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白。另外，本方案通过亲和层析捕获His标签的目的蛋白。再经过离子交换纯化去除未带硒代蛋氨酸的目的蛋白。
附图说明
[0012]图1是本方案的实施例的镍柱亲和洗脱峰图的示意图；
[0013]图2是亲和捕获目的蛋白的纯度结果图；
[0014]图3是离子交换洗脱峰图；
[0015]图4是离子交换洗脱纯度结果图；
[0016]图5是SEC
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HPLC纯度峰图。
具体实施方式
[0017]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0018]本领域技术人员应理解的是，在本专利技术的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本专利技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本专利技术的限制。
[0019]可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。
[0020]一种硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白制备方法，包括以下步骤：
[0021]将含有His D基因的质粒转化到大肠杆菌的BL21感受态中，并置于LB培养基中过夜培养挑选出阳性克隆；
[0022]将阳性克隆接入完全培养基中置于常温环境下的摇床进行培养使得阳性克隆标
记上硒代蛋氨酸，其中所述完全培养基的成分包括40X可溶氨基酸混合物、100X不可溶氨基酸混合物、10X缓冲液A、40％葡萄糖、金属盐溶液、抗生素以及维生素B1
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硒代甲硫氨酸混合物；
[0023]加入异丙基
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β
‑
D
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硫代半乳糖苷和锌离子诱导过夜，离心去上清液后用重悬Buffer A重悬菌体并进行纯化得到硒代蛋氨酸标记的His D蛋白。
[0024]具体的，本方案将正确重组的含有His D基因的质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，以使得重组后的含His D基因的质粒导入到大肠杆菌BL21感受态细胞中进而实现对目的蛋白的高效表达。重组指的是将目标基因或DNA片段插入到质粒DNA中的过程，在本方案中指的是将His D基因插入到质粒中，His D基因是一种编码蛋白质的基因，它通常被本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有His D基因的质粒转化到大肠杆菌的BL21感受态中，并置于LB培养基中过夜培养挑选出阳性克隆；将阳性克隆接入完全培养基中置于常温环境下的摇床进行培养使得阳性克隆标记上硒代蛋氨酸，其中所述完全培养基的成分包括40X可溶氨基酸混合物、100X不可溶氨基酸混合物、10X缓冲液A、40％葡萄糖、金属盐溶液、抗生素以及维生素B1
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硒代甲硫氨酸混合物；加入异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷和锌离子诱导过夜，离心去上清液后用重悬Buffer A重悬菌体并进行纯化得到硒代蛋氨酸标记的His D蛋白。2.根据权利要求1所述的硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白的制备方法，其特征在于，对重悬后的菌体进行破碎处理后，利用亲和层析捕获带His标签的目的蛋白，再利用离子交换纯化去除未带硒代蛋氨酸的目的蛋白。3.根据权利要求1所述的硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白的制备方法，其特征在于，置于完全培养基中进行培养的条件是：37℃，160RPM培养至OD600＝0.8
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1.0，摇床降温至16℃。4.根据权利要求1所述的硒代甲硫氨酸标记的His D蛋白的制备方法，其特征在于，40X可溶氨基酸混合物含有精氨酸,天冬氨酸,天冬酰胺,丙氨酸,谷氨酸,谷氨酰胺,甘氨酸,组氨酸,脯氨酸,丝氨酸,半胱氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸,异亮氨酸,苏氨酸,...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶才渊，王贤淼，
申请(专利权)人：杭州美赛生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：