一种抗LAG3纳米抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于抗体制备技术领域，具体涉及一种抗LAG3纳米抗体及其制备方法与应用。本发明专利技术提供的LAG3纳米抗体，氨基酸序列为SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8中的一种；制备过程如下：构建LAG3抗原对羊驼进行免疫后，获得羊驼PBMC细胞；对细胞进行RNA的捕获，反转录为cDNA，进行PCR获得抗体基因片段，构建到载体上；通过单克隆哺乳动物细胞高通量表达系统进行高通量表达；最后通过ELISA与FACS检测，并测序验证即得。本发明专利技术提供的制备方法操作简便，且哺乳动物细胞表达系统诱导抗体高效表达，翻译后可进行加工修饰，其活性更接近于天然抗体。其活性更接近于天然抗体。其活性更接近于天然抗体。

【技术实现步骤摘要】
NO.6。
[0007]CDR1：DYFMS(SEQ ID NO.1)；
[0008]CDR2：DINDGGGSAFYADSVKG(SEQ ID NO.2)；
[0009]CDR3：GYISGDYYSLDY(SEQ ID NO.3)；
[0010]CDR1：SYYMS(SEQ ID NO.4)；
[0011]CDR2：DINAGGDSTYYSDSVKG(SEQ ID NO.5)；
[0012]CDR3：DVGYDGDYGLGAEYDY(SEQ ID NO.6)。
[0013]优选地，所述抗LAG3纳米抗体具有选自以下任一种的氨基酸序列：SEQ IDNO.7(ANb22
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M120
‑
4M
‑
3LP
‑
106)、SEQ ID NO.8(ANb22
‑
M120
‑
4M
‑
3LP
‑
319)。
[0014]优选地，编码所述纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列为下列序列之一：SEQ ID NO.9(ANb22
‑
M120
‑
4M
‑
3LP
‑
106)、SEQ ID NO.10(ANb22
‑
M120
‑
4M
‑
3LP
‑
319)。
[0015]本专利技术还提供了一种核酸分子载体，所述核酸分子载体包含权利要求3所述SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10的核苷酸序列中的一种。
[0016]本专利技术还提供了一种含有所述的核酸分子载体的宿主细胞，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK
‑
293细胞或CHO细胞。
[0017]本专利技术还提供了一种所述抗LAG3纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0018]S1、依据LAG3的蛋白序列和基因序列信息，表达LAG3免疫抗原；
[0019]S2、用步骤S1获得的LAG3抗原对羊驼进行多次免疫后，提取羊驼PBMC细胞；
[0020]S3、以步骤S2获得的羊驼PBMC细胞为原材料，通过单个细胞微流控技术筛选到阳性抗体分泌细胞，提取上述阳性分泌细胞的RNA，并反转录成cDNA，经PCR获得目的基因片段，然后将目的基因片段克隆至载体中。
[0021]S4、通过哺乳动物细胞高通量表达系统诱导LAG3抗体高通量表达，通过抗体检测技术如ELISA与FACS等方法进行抗原结合检测，并进行测序分析，最终获得抗LAG3的纳米抗体。
[0022]本专利技术还提供了一种利用所述制备方法制得的抗LAG3纳米抗体。
[0023]本专利技术还提供了一种所述的抗LAG3纳米抗体在制备检测T细胞表面蛋白试剂中的应用。
[0024]本专利技术还提供了一种所述抗LAG3纳米抗体在制备治疗血液肿瘤和实体瘤药物中的应用。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的技术优势如下：本专利技术提供的抗LAG3纳米抗体的制备方法有效地降低了目的抗体的开发和生产成本，缩减了抗体表达时间，同时本专利技术哺乳动物细胞高通量表达系统使用96孔细胞培养板表达，增加了通量，提高了纳米抗体的表达效率。
附图说明
[0026]图1为不同稀释度下的血清效价检测结果；
[0027]图2～3为抗原与瞬转上清结合检测结果；
[0028]图4为细胞结合试验检测结果；
[0029]图5为细胞阻断试验检测结果。
具体实施方式
[0030]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本专利技术，而不能用来限制本专利技术，所有与本专利技术相同或相近的技术方案均在本专利技术的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0031]实施例一种LAG3纳米抗体的制备方法
[0032]所述LAG3纳米抗体的制备方法，包括如下过程：
[0033]S1、依据LAG3的蛋白序列和基因序列信息，表达免疫抗原(可以是LAG3的全序列)，并在其C端连接His
‑
tag，获得经修饰的氨基酸，用于后续纯化及检测；
[0034]S2、用步骤S1获得的经修饰的抗原与弗氏佐剂的混合液对羊驼进行四次免疫，获得羊驼PBMC细胞：用200μg human LAG3/His蛋白(即步骤S1所得经修饰的氨基酸)与200μL弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，在第21天、42天、63天用200μghuman LAG3/His蛋白与200μL弗氏不完全佐剂加强免疫3次，每次免疫1周后，采血检测Anti
‑
LAG3/His血清滴度；第4次免疫1周后，采血50mL用于筛选建库。
[0035]Anti
‑
LAG3/His血清效价通过ELISA检测，检测过程如下：用浓度为2μg/mL的LAG3/His蛋白包被酶标板，每孔加入2倍梯度稀释(即每孔稀释至前1孔的2倍)的经四次免疫后获得的血清100μL(对照为免疫前羊驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti
‑
Alpaca IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤5次后，加100μL TMB底物，37℃孵育10min，50μL 0.1M的H2SO4中止反应，测定OD 450nm。当待测样本的OD450值大于阴性对照的3倍以上，判为抗血清效价为阳性，结果如图1所示，图1所示为4免后的抗血清效价为3200。由此可见，该抗原可诱导羊驼产生特异性针对LAG3蛋白的高滴度抗血清。
[0036]S3、以步骤S2获得的50mL血样为原材料，用微流控平台进行有功能的抗体分泌细胞分选，液滴微流控技术可以将细胞与抗原包裹在一个个皮升级别的单分散油滴中，可以达到每秒数千个单分散液滴的生成速度，获取单细胞每个微液滴都是独立的，实现了细胞与细胞之间的环境独立，互不交叉污染；在油滴内通过荧光标记的羊驼二抗去识别VHH，同时如果细胞分泌的VHH抗体能够识别荧光标记的抗原，就能形成FRET信号而被分选出来，筛选得到可以分泌VHH有结合活性的B细胞。
[0037]用Trizol法提取所获得的有功能的抗体分泌细胞的RNA，并利用oligo(dT)反转为cDNA(反转录试剂盒为TaKaRa
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SMARTcribe Reverse Transcript)，通过PCR扩增获得目的片段；将目的基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1中。
[0038]提取质粒：挑取单克隆菌落至96孔深孔板中，37℃震荡摇床培养8h；离心后将所获得的菌液进行高通量质粒提取，按照碱裂解法提取质粒DNA，将培养菌液的96孔深孔板置于水平离心机中，离心，弃上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗LAG3纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括框架区和互补决定区；所述互补决定区包括CDR1、CDR2、CDR3，其中，所述互补决定区CDR1序列为SEQ ID NO.1，所述互补决定区CDR2序列为SEQ ID NO.2，所述互补决定区CDR3序列为SEQ ID NO.3；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.4，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.5，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.6。2.如权利要求1所述的抗LAG3纳米抗体，其特征在于，所述抗LAG3纳米抗体具有选自以下任一种的氨基酸序列：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。3.如权利要求2所述的抗LAG3纳米抗体，其特征在于，编码所述抗LAG3纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列为下列序列之一：SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10。4.一种核酸分子载体，其特征在于，所述核酸分子载体包含SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10的核苷酸序列中的一种。5.一种含有权利要求4所述的核酸分子载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立凤，杨燕，于蒙，郭淑梅，王亮，杜继文，
申请(专利权)人：上海百英生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：