一种抗CD40纳米抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种抗CD40纳米抗体及其制备方法与应用。本发明专利技术提供的抗CD40纳米抗体具有独特的3个互补决定区，即CDR1、CDR2、CDR3，本发明专利技术还提供了编码上述纳米抗体或其VHH链的编码序列、相应的表达载体和能够表达该纳米抗体的宿主细胞。本发明专利技术首先通过构建CD40抗原对羊驼进行免疫，获得羊驼PBMC细胞构建载体；其次通过噬菌体展示系统筛选出Anti

【技术实现步骤摘要】
一种抗CD40纳米抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种抗CD40纳米抗体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]CD40是一种48kDa大小的Ⅰ型跨膜蛋白，是连接固有免疫和适应性免疫的重要免疫细胞通讯介质。CD40存在于血小板、B细胞和髓系细胞，但也存在于非造血细胞，如内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞甚至某些类型的肿瘤细胞。CD40的同源配体是CD154（TNFSF5/CD40L），一种39kda的II型跨膜蛋白。CD40L的表达通常可诱导并局限于造血系统的细胞，如血小板、粒细胞、活化T细胞、活化B细胞和活化自然杀伤细胞（NK）细胞，但内皮细胞和平滑肌细胞也有弱表达。
[0003]CD40在单核细胞及其子代巨噬细胞和DC细胞以及B细胞上的表达在发挥免疫细胞的功能中起着重要作用。单核细胞是固有免疫前体细胞，具有很高的可塑性。它们具有分化为多种细胞类型的能力，如巨噬细胞、髓源性抑制细胞（MDSC）和DC细胞。CD40信号是单核细胞成熟过程的重要触发因素，主要驱动分化为M1谱系的巨噬细胞和DC细胞。CD40与DC细胞表面的结合促进了细胞因子和趋化因子的产生，诱导共刺激分子的表达，并促进抗原的交叉呈递。CD40L的主要功能之一是通过激活DC细胞来增强抗原对T细胞的提呈。这一步称为“许可”，通过上调表面蛋白如CD54和CD86，增加DC与T细胞的相互作用，从而激活后者。鉴于CD40的一般表达谱和生物活性，CD40激动剂与其他治疗方案的联合应用已在临床前模型中进行了研究。CD40靶向治疗与其他免疫调节剂或检查点抑制剂的使用在各种癌症模型中显示出巨大的潜力。例如，使用激动剂抗CD40抗体结合化疗或激酶抑制剂的临床前研究已显示出有良好的前景。
[0004]1993年，Hamers团队研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼) 的血液中发现了一类仅有重链二聚体的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体缺乏轻链，因此称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody， HCAbs)，它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。
[0005]由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kDa，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体。这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。相比于常规的抗体而言，纳米抗体在亲和力方面与其常规抗体对应的scFv相当，纳米抗体相比于常规抗体或者scFv抗体具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值及发展前景。
[0006]噬菌体展示技术、生物淘洗等都是进行纳米抗体生产的常用技术，其中噬菌体展示技术需要噬菌体的包装及淘选，此技术均是在原核表达系统中进行，成本较低，技术难度低，易于操作。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种抗CD40纳米抗体及其制备方法与应用。本专利技术利用一种PCR的手段将基因片段直接导入真核细胞，表达后用于后续检测，降低了更换真核载体的高成本，同时减少了时间消耗。
[0008]为了达到上述技术效果，本专利技术采用的技术方案为：一种抗CD40纳米抗体，所述纳米抗体包括框架区和互补决定区；所述互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.1，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.2，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.3；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.4，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.5，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.6；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.1，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.7，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.8；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.9，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.10，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.11；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.12，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.13，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.14；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.12，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.15，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.16；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.17，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.18，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.19；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.9，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.20，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.21。
[0009]表1 本专利技术纳米抗体可变区氨基酸序列所述抗CD40纳米抗体具有选自以下任一种的氨基酸序列：ANb24
‑
Alpaca1
‑
4M
‑
2SP
‑
149对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.22；ANb24
‑
Alpaca1
‑
4M
‑
2SP
‑
175对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.23、ANb24
‑
Alpaca1
‑
4M
‑
2SP
‑
180对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.24、
ANb24
‑
Alpaca1
‑
4M
‑
2SP
‑
226对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.25、ANb24
‑
Alpaca1
‑
4M
‑
2SP
‑
273对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.26、ANb24
‑
Alpaca1
‑
4M
‑
2SP
‑
317对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.27、ANb24
‑
Alpaca1
‑
4M
‑
2SP
‑
332对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.28、ANb24
‑
Alpaca1
‑
4M
‑
2SP
‑
335对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.29。
[0010]本专利技术纳米抗体的组成均为fr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗CD40纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括框架区和互补决定区；所述互补决定区包括CDR1、CDR2、CDR3，氨基酸序列如下：其中，所述互补决定区CDR1序列为SEQ ID NO.1，所述互补决定区CDR2序列为SEQ ID NO.2，所述互补决定区CDR3序列为SEQ ID NO.3；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.4，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.5，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.6；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.1，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.7，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.8；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.9，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.10，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.11；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.12，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.13，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.14；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.12，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.15，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.16；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.17，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.18，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.19；或者所述互补决定区CDR1为SEQ ID NO.9，所述互补决定区CDR2为SEQ ID NO.20，所述互补决定区CDR3为SEQ ID NO.21。2.如权利要求1所述的抗CD40纳米抗体，其特征在于，所述抗CD40纳米抗体具有选自以下任一种的氨基酸序列：SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29。3.如权利要求2所述的抗CD40纳米抗体，其特征在于，编码所述纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜继文，薛静，杨燕，袁亚丰，许胤辉，丁惠，王玉芳，查长春，
申请(专利权)人：上海百英生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：