一种亲和力成熟方法及抗人PD-L1单域抗体的亲和力成熟技术

本发明专利技术提供了一种亲和力成熟方法及抗人PD

【技术实现步骤摘要】
一种亲和力成熟方法及抗人PD
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L1单域抗体的亲和力成熟


[0001]本专利技术属于生物医药及抗体工程领域，具体而言，涉及一种抗体亲和力成熟方法。

技术介绍

[0002]目前抗体的开发主要源于小鼠杂交瘤技术和体外抗体库技术，通过抗原设计和抗体筛选初步获得候选抗体，然后通过一系列相关的生物性质检测和功能验证，最终得到有应用价值的抗体。在实际开发过程中，经过常规筛选方法得到的抗体有许多性能需要改进，例如亲和力、免疫原性、半衰期等，其中抗体亲和力成熟是最重要的改进方向之一。发展抗体亲和力成熟技术，不仅有助于改善抗体的特异性和效力，减少抗体药的用药剂量，降低毒副作用，也有助于人们更好地理解抗体与靶点相互作用的机理，更好地认识靶点功能。
[0003]近年来,随着人类对体内抗体亲和力成熟研究的逐步深入，同时抗体工程研究的迅速兴起，使得体外抗体亲和力成熟研究逐渐成为一个研究热点。体外抗体亲和力成熟是属于体外功能蛋白质分子进化的范畴。它的研究策略多是在基于对体内抗体亲和力成熟规律认识的基础上提出的，大多模拟体内抗体亲和力成熟的方式。目本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗体亲和力成熟方法，其特征在于，具体为CDR区全覆盖的单点饱和突变与哺乳系统超高通量表达筛选系统相结合的方法；所述的CDR区全覆盖的单点饱和突变的方法，具体为通过等比的引物混合物对抗体CDRs区的每一个氨基酸进行无偏差全覆盖的突变。2.根据权利要求1所述的亲和力成熟方法，其特征在于，所述的哺乳系统超高通量表达筛选系统的方法，包括如下步骤：1）使用96孔细胞培养板，每个孔只表达一个氨基酸突变的单一抗体，同时表达数千个微孔，覆盖CDR区的所有突变点；2）使用亲和力筛选ELISA方法，对所有表达的上清做亲和力筛选，得到高亲和力的突变热点。3.根据权利要求1所述的亲和力成熟方法，其特征在于，所述的哺乳系统超高通量表达筛选系统的方法，使用的表达筛选细胞为哺乳动物表达细胞，消除了常规展示系统中展示系统蛋白对抗体检测的影响。4.根据权利要求2所述的亲和力成熟方法，其特征在于，所述的亲和力筛选ELISA的方法，具体为通过均一性捕获表达上清中的抗体，以消除浓度差异的影响，进而实现通过显色差异来反映亲和力差异。5.根据权利要求1所述的亲和力成熟方法，其特征在于，包括如下步骤：1）通过上述单点饱和突变技术构建抗体的突变子并验证；2）将突变子重组至表达载体中；3）高通量抽提质粒并转染哺乳动物细胞表达；4）通过正交ELISA及夹心ELISA筛选突变热点；5）通过易错PCR进行热点组合；6）通过夹心ELISA对热点组合抗体进行相对亲和力排序；7）选择亲和力提高的抗体进行表达并检测亲和力。6.根据权利要求5所述的亲和力成熟方法，其特征在于，所述步骤1）包括构建抗体的CDRs中的所有氨基酸的突变子，每个氨基酸的单点饱和突变具体过程如下：利用引物A1和引物A2扩增突变点前的抗体基因片段A，利用引物B1和引物B2引入突变并扩增突变点后的抗体基因片段B，其中引物B1与引物A2存在重叠序列，且引物B1包括无偏差的18种氨基酸的突变引物等比混合而成的引物，这18条引物在突变点处设计突变碱基：通过引物A2和B1的重叠序列将基因片段A和片段B进行拼接，通过带有重组臂的巢式PCR引物扩增VHH抗体基因片段，得到突变子。7.根据权利要求5所述的亲和力成熟方法，其特征在于，所述步骤2）中，表达载体为pcDNA3.4，酶切位点为HindIII和BamHI。8.根据权利要求5所述的亲和力成熟方法，其特征在于，所述步骤3）中，表达细胞为人胚肾HEK293细胞。9.高亲和力的抗人PD
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L1单域抗体，其特征在于，所述的单域抗体的序列包括互补决定区CDR；所述互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；所述的单域抗体的互补决定区CDR的氨基酸序列为下述（1）
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（15）中的任意一组：（1）氨基酸序列为GQE的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的CDR2，氨基酸序列如
SEQ ID NO：2所示的CDR3；（2）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的CDR3；（3）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的CDR3；（4）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的CDR3；（5）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的CDR3；（6）氨基酸序列为GME的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示的CDR3；（7）氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉芳，卢海松，刘川，唐静秋，
申请(专利权)人：上海百英生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：