结合NKG2D、CD16和CLEC12A的蛋白质制造技术

本文描述了结合NKG2D受体、CD16和CLEC12A的多特异性结合蛋白，包含这些多特异性结合蛋白的药物组合物，以及可用于治疗癌症的治疗方法。法。法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结合NKG2D、CD16和CLEC12A的蛋白质
[0001]本申请要求于2020年5月6日提交的美国临时申请号63/020,798的优先权，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。序列表
[0002]ASCII文本格式的序列表的计算机可读形式(CRF)通过引用以其全文并入本申请。序列表文本文件标题为“14247
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540
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228_SEQ_LISTING”，创建于2021年5月3日，并且大小为291,375字节。


[0003]本申请涉及结合细胞上NKG2D、CD16和CLEC12A的多特异性结合蛋白，包含这些蛋白质的药物组合物，以及使用这些蛋白质及药物组合物的治疗方法，包括用于治疗癌症。

技术介绍

[0004]尽管进行了大量研究努力，但癌症仍是全球各国的重大临床及财政负担。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)，其是第二大死因。手术、放射疗法、化学疗法、生物疗法、免疫疗法、激素疗法、干细胞移植及精准医疗均为现有的治疗方式。尽管在这些领域进行了广泛研究，但尚未鉴别出尤其用于最具侵袭性的癌症的高度有效的治愈性解决方案。另外，许多现有的抗癌治疗方式具有显著不良的副作用。
[0005]癌症免疫疗法是合意的，这是因为其具有高度特异性且可利用患者的自身免疫系统帮助破坏癌细胞。融合蛋白(例如双特异性T细胞接合物)是文献中所述结合至肿瘤细胞和T细胞以帮助破坏肿瘤细胞的癌症免疫疗法。文献中已描述结合至某些肿瘤相关抗原的抗体。参见例如WO2016/134371及WO 2015/095412。
[0006]自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的组分且构成约15％的循环淋巴细胞。NK细胞几乎浸润所有组织且最初的特征在于其无需先前敏化即可有效地杀伤肿瘤细胞的能力。活化的NK细胞通过与细胞毒性T细胞相似的方式(即经由含有穿孔蛋白及颗粒酶的溶细胞颗粒以及经由死亡受体路径)杀伤靶细胞。活化的NK细胞也分泌促进其他白血球募集至靶组织的炎性细胞因子，例如IFN
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γ及趋化因子。
[0007]NK细胞经由其表面上的多种活化及抑制受体对信号起反应。例如，当NK细胞遇到健康的自身细胞时，其活性经由活化杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)受到抑制。可替代地，当NK细胞遇到外源细胞或癌细胞时，其经由其活化受体(例如NKG2D、NCR、DNAM1)活化。NK细胞也经由其表面上的CD16受体由一些免疫球蛋白的恒定区活化。NK细胞对活化的总体敏感性取决于刺激及抑制信号的总和。NKG2D是由基本上所有的自然杀伤细胞表达的II型跨膜蛋白，其中NKG2D用作活化受体。也在T细胞上发现NKG2D，其中NKG2D用作共刺激受体。经由NKG2D调节NK细胞功能的能力可用于多个治疗背景下，包括恶性病。
[0008]C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A，也称为C型凝集素样分子
‑
1(CLL
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1)或骨髓抑制性C型凝集素样受体(MICL))是C型凝集素/C型凝集素样结构域(CTL/CTLD)超家族的成员。该家族成员共有共同的蛋白质折叠，并在炎症和免疫应答中具有多种功能(如细胞粘
附、细胞间信号传导、糖蛋白周转)和作用。CLEC12A是一种II型跨膜糖蛋白，在超过90％的急性髓系白血病患者的白血病干细胞上过表达，但在正常造血细胞上不表达。
[0009]尽管一些生物技术和制药公司做出了许多努力，但缺乏具有良好可开发特征的抗体阻碍了特异性CLEC12A靶向生物制剂的开发。发现CLEC12A抗体的挑战可能归因于抗原的复杂性。CLEC12A是高度糖基化的单体蛋白，在具有201个氨基酸的细胞外结构域内具有六个潜在的N
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糖基化位点。六个N
‑
糖基化位点中的四个聚集在分子的膜近侧结构域中，并且可能参与靶标在细胞表面上的呈递。已经报道了不同细胞类型表面上CLEC12A糖基化状态的变化(Marshall等人,(2006)Eur J Immunol.[欧洲免疫学杂志]36(8):2159
‑
69)。
[0010]因此，该领域仍需要新且有用的结合CLEC12A的蛋白质用于治疗癌症。

技术实现思路

[0011]本申请提供结合至自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以及CLEC12A的多特异性结合蛋白。这些蛋白质可接合一种以上的NK活化受体，并且可阻断天然配体与NKG2D的结合。在某些实施例中，蛋白质可以激动人类中的NK细胞。在一些实施例中，蛋白质可以激动人类及其他物种(例如啮齿类动物及食蟹猴)中的NK细胞。还提供含有本文披露的蛋白质中的任一者的配制品；含有一种或多种表达这些蛋白质的核酸的细胞以及使用这些蛋白质增强肿瘤细胞死亡的方法。
[0012]因此，在一个方面中，本申请提供包含以下的蛋白质：(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合CLEC12A的第二抗原结合位点；以及(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其一部分，或结合CD16的第三抗原结合位点；其中该结合CLEC12A的第二抗原结合位点包含：(i)重链可变结构域(VH)，其包含分别含有SEQ ID NO:137、272和273的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)及互补决定区3(CDR3)；以及轻链可变结构域(VL)，其包含分别含有SEQ ID NO:140、141和142的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(ii)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:137、138和139的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:140、141和142的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(iii)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:251、196和246的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:198、199和201的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(v)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:221、166和223的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:240、226和179的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(v)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:206、166和241的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:245、239和179的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(vi)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:221、236和223的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:152、226和179的氨基酸序列的CDR1、CDR2和
CDR3；(vii)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:159、170和183的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种蛋白质，其包含：(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合CLEC12A的第二抗原结合位点；以及(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其一部分，或结合CD16的第三抗原结合位点；其中该结合CLEC12A的第二抗原结合位点包含：(i)重链可变结构域(VH)，其包含分别含有SEQ ID NO:137、272和273的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)及互补决定区3(CDR3)；以及轻链可变结构域(VL)，其包含分别含有SEQ IDNO:140、141和142的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(ii)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:137、138和139的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:140、141和142的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(iii)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:251、196和246的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:198、199和201的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(iv)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:221、166和223的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:240、226和179的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(v)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:206、166和241的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:245、239和179的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(vi)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:221、236和223的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:152、226和179的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(vii)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:159、170和183的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:186、188和189的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(viii)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:197、202和207的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:211、212和214的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(ix)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:220、222和257的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:224、225和227的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或者(x)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:233、234和235的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。2.如权利要求1所述的蛋白质，其中该结合CLEC12A的第二抗原结合位点包含(i)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:137、272和273的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:140、141和142的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或者(ii)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:137、138和139的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:140、141和142的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。3.如权利要求1或2所述的蛋白质，其中(i)该VH包含与SEQ ID NO:335至少90％相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:336至少90％相同的氨基酸序列；(ii)该VH包含与SEQ ID NO:270至少90％相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:271至少90％相同的氨基酸序列；或者
(iii)该VH包含与SEQ ID NO:178至少90％相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:289至少90％相同的氨基酸序列。4.如权利要求1至3中任一项所述的蛋白质，其中(i)该VH包含SEQ ID NO:335的氨基酸序列，并且该VL包含SEQ IDNO:336的氨基酸序列；(ii)该VH包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，并且该VL包含SEQ IDNO:271的氨基酸序列；或者(iii)该VH包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列，并且该VL包含SEQ IDNO:289的氨基酸序列。5.如权利要求1或2所述的蛋白质，其中该VH和该VL分别包含SEQ ID NO:143和144；147和144；244和144；178和144；256和144；143和163；143和167；143和171；或174和175的氨基酸序列。6.如权利要求1至5中任一项所述的蛋白质，其中该第二抗原结合位点以单链可变片段(scFv)存在，并且其中该scFv包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:274、145、146、149、150、153、154、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180和181。7.如权利要求6所述的蛋白质，其中该scFv包含SEQ ID NO:274或SEQ ID NO:180的氨基酸序列。8.如权利要求1所述的蛋白质，其中该结合CLEC12A的第二抗原结合位点包含VH，其包含分别含有SEQ ID NO:251、196和246的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:198、199和201的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。9.如权利要求1所述的蛋白质，其中该结合CLEC12A的第二抗原结合位点包含：(i)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:195、196、187的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:198、199、201的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(ii)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:192、196和187的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:198、199和201的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或者(iii)VH，其包含分别含有SEQ ID NO:192、196和213的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及VL，其包含分别含有SEQ ID NO:198、199和201的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。10.如权利要求1和8至9中任一项所述的蛋白质，其中该VH包含与SEQ ID NO:148至少90％相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ IDNO:203至少90％相同的氨基酸序列。11.如权利要求1和8至10中任一项所述的蛋白质，其中该VH包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列。12.如权利要求11所述的蛋白质，其中该VH和该VL分别包含SEQ ID NO:162和203；210和203；162和218；148和218；或210和218的氨基酸序列。13.如权利要求8至12中任一项所述的蛋白质，其中该第二抗原结合位点以scFv存在，并且其中该scFv包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:184、185、204、205、208、209、215、216、252、253、254和255。14.如权利要求13所述的蛋白质，其中该scFv包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列。15.如前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中该第二抗原结合位点以不依赖于糖
基化的方式结合CLEC12A。16.一种蛋白质，其包含：(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合CLEC12A的第二抗原结合位点；以及(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其一部分，或结合CD16的第三抗原结合位点；其中该第二抗原结合位点以不依赖于糖基化的方式结合CLEC12A。17.如权利要求1至16中任一项所述的蛋白质，其中该第二抗原结合位点结合人类CLEC12A，其中解离常数(K
D
)小于或等于20nM，如通过表面等离子体共振(SPR)所测量。18.如权利要求1至7和16至17中任一项所述的蛋白质，其中该第二抗原结合位点结合人类CLEC12A，其中K
D
小于或等于1nM，如通过SPR所测量。19.如权利要求1至7和15至18中任一项所述的蛋白质，其中该第二抗原结合位点结合包含K244Q取代的人类CLEC12A。20.如权利要求1至19中任一项所述的蛋白质，其中该蛋白质包含足以结合CD16的抗体Fc结构域或其一部分。21.如权利要求1至20中任一项所述的蛋白质，其中该结合NKG2D的第一抗原结合位点是Fab片段，并且该结合CLEC12A的第二抗原结合位点是scFv。22.如权利要求1至5、8至12和15至20中任一项所述的蛋白质，其中该结合NKG2D的第一抗原结合位点是scFv，并且该结合CLEC12A的第二抗原结合位点是Fab片段。23.如权利要求1至20中任一项所述的蛋白质，其进一步包含结合CLEC12A的另外的抗原结合位点。24.如权利要求23所述的蛋白质，其中该结合NKG2D的第一抗原结合位点是scFv，并且该结合CLEC12A的第二抗原结合位点及另外的抗原结合位点各自是Fab片段。25.如权利要求23所述的蛋白质，其中该结合NKG2D的第一抗原结合位点是scFv，并且该结合CLEC12A的第二抗原结合位点及另外的抗原结合位点各自是scFv。26.如权利要求23至25中任一项所述的蛋白质，其中该第二抗原结合位点及另外的抗原结合位点的氨基酸序列是相同的。27.一种蛋白质，其包含：(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合CLEC12A的第二抗原结合位点；以及(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其一部分，或结合CD16的第三抗原结合位点；其中该结合NKG2D的第一抗原结合位点是Fab片段，并且该结合CLEC12A的第二抗原结合位点是scFv。28.如权利要求22、24至26中任一项所述的蛋白质，其中该结合NKG2D的scFv经由包含Ala
‑
Ser或Gly
‑
Ser的铰链连接至足以结合CD16的抗体恒定结构域或其一部分。29.如权利要求21和25至28中任一项所述的蛋白质，其中结合CLEC12A的每个scFv经由包含Ala
‑
Ser或Gly
‑
Ser的铰链连接至足以结合CD16的抗体恒定结构域或其一部分。30.如权利要求28或29所述的蛋白质，其中该铰链进一步包含氨基酸序列Thr
‑
Lys
‑
Gly。31.如权利要求22、24至26、28和30中任一项所述的蛋白质，其中在该结合NKG2D的scFv
内，该scFv的重链可变结构域与该scFv的轻链可变结构域形成二硫桥。32.如权利要求21、25至27和30至31中任一项所述的蛋白质，其中在结合CLEC12A的每个scFv内，该scFv的重链可变结构域与该scFv的轻链可变结构域形成二硫桥。33.如权利要求31或32所述的蛋白质，其中该二硫桥是在该重链可变结构域的C44与该轻链可变结构域的C100之间形成，根据Kabat编号方案编号。34.如权利要求22、24至26、28、30至31和33中任一项所述的蛋白质，其中在该结合NKG2D的scFv内，该重链可变结构域经由柔性接头连接至该轻链可变结构域。35.如权利要求21、25至27、29至30和32至34中任一项所述的蛋白质，其中在结合CLEC12A的每个scFv内，该重链可变结构域经由柔性接头连接至该轻链可变结构域。36.如权利要求34或35所述的蛋白质，其中该柔性接头包含(G4S)4。37.如权利要求22、24至26、28、30至31、33至34和36中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：蜻蜓疗法股份有限公司，
类型：发明
国别省市：