一种抑制牛CD44基因表达的shRNA序列及应用制造技术

本发明专利技术公开一种抑制牛CD44基因表达的shRNA序列及应用，涉及一种有效的抑制牛CD44基因的表达的shRNA，即CD44 LV

【技术实现步骤摘要】
一种抑制牛CD44基因表达的shRNA序列及应用


[0001]本专利技术涉及抑制牛CD44基因表达的shRNA序列及其用途，尤其是公开一种抑制牛CD44基因表达的shRNA序列及应用，属于生物医药

技术背景
[0002]牛的CD44基因定位于第15号染色体中，含有17个外显子和，CD44分子的转录序列存在多种剪接形式，目前，牛的CD44可能存在有9个转录本。牛骨髓间充质干细胞研究发现细胞表明抗原存在CD44，目前CD44在牛的干细胞和胚胎研究较多，通过诱导骨髓间充质干细胞成功分化为成骨细胞，脂肪细胞，肝和胰岛样细胞，表明CD44作为细胞表面抗原可能对细胞分化存在调控作用。
[0003]短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）是一种基于RNA干扰（RNA interference，RNAi）原理，将小干扰RNA（smallinterference，siRNA）在细胞或者体内转录表达出来，抑制或降解特定基因mRNA或抑制mRNA翻译的一种有效方法，从而达到抑制基因表达的方法，被广泛应用于医药研发和农林科技等多个领域。采用事先在体外构建的慢病毒shRNA载体，然后通过慢病毒介导转染到细胞内，不但使shRNA有效应用的细胞种类增加，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

技术实现思路

[0004]本专利技术公开一种抑制牛CD44基因表达的shRNA序列及应用，涉及一种有效的抑制牛CD44基因的表达的shRNA，即CD44 LV
‑
shRNA 592；通过慢病毒载体构建和慢病毒包装技术，进一步提高载体转入细胞和活体动物的效率以及shRNA载体表达和发挥作用的周期，提高了shRNA抑制基因表达的效果。
[0005]本专利技术的目的在于公开的一种抑制牛CD44基因表达的CD44 LV
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shRNA 592序列，是提供有效抑制牛CD44基因mRNA的shRNA分子序列，CD44 LV
‑
shRNA592序列，其基因序列如SEQ ID：NO.1所示：5
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GCCTTTGAAGGACCAATTACCTTCAAGAGAGGTAATTGGTCCTTCAAAGGC3
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，其中，TTCAAGAGA为颈环序列；本专利技术的第二目的是提供上述shRNA抑制牛CD44基因表达的shRNA构建于慢病毒载体上，插入shRNA的DNA双链，其中：CD44 LV
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shRNA 592正义链序列为：5
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GATCCGCCTTTGAAGGACCAATTACCTTCAAGAGAGGTAATTGGTCCTTCAAAGGCTTTTTG3
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：CD44 LV
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shRNA 592反义序列为：5
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AATTCAAAAAAGCCTTTGAAGGACCAATTACCTCTCTTGAAGGTAATTGGTCCTTCAAAGGC3
’
。
[0006]本专利技术第三目的是提供了上述牛CD44基因的shRNA慢病毒载体转入细胞或体内抑制CD44表达的RNA干扰序列，有效抑制牛CD44表达，抑制牛CD44基因的shRNA分子序列在制备抑制牛CD44基因表达方面的应用。
[0007]本专利技术第四目的是将所述抑制牛CD44基因表达的shRNA构建于慢病毒载体上，转入细胞或活体动物能有效抑制牛CD44基因在mRNA及蛋白水平的表达，适用于调控细胞和体内CD44表达基因方面的应用。同时，在提高牛肉质性状和抗病能力的分子育种和转基因动物制备过程中具有应用前景。
[0008]本专利技术的积极效果在于：提供了一种有效的抑制牛CD44基因的表达的shRNA：CD44 LV
‑
shRNA 592；通过慢病毒载体构建和慢病毒包装技术，进一步提高载体转入细胞和活体动物的效率以及shRNA载体表达和发挥作用的周期，提高了shRNA抑制基因表达的效果。在细胞和活体中降低CD44表达水平，以及今后解析牛CD44基因作用机理提供有效手段，同时，在牛的分子育种和转基因动物制备过程中，具有重要的应用前景和经济价值。
附图说明
[0009]图1 为本专利技术牛CD44基因shRNA慢病毒载体插入序列；图2 为本专利技术慢病毒感染后48 h牛前体脂肪细胞中绿色荧光蛋白表达；图3 为本专利技术CD44基因mRNA的相对表达水平；图4 为本专利技术牛脂肪细胞中甘油三酯含量；其中，（１）CD44抑制后牛前体脂肪细胞甘油三酯含量；（２）CD44抑制后牛前体脂肪细胞内胆固醇含量；（３）CD44抑制后牛脂肪细胞甘油三酯含量；（４）CD44抑制后牛脂肪细胞胆固醇含量。
具体实施方式
[0010]通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术，在不背离本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本专利技术的权利要求范围之内。
[0011]实施例1shRNA的设计与载体构建根据GenBank数据库公布的牛CD44基因的mRNA序列（http://www .ncbi .nlm .nih .gov/genbank），序列号为NM_174013.3。同时根据shRNA序列的设计原则，选择了靶序列，以确保载体的有效性，靶序列为：5
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GCCTTTGAAGGACCAATTACC 3
’
；根据上述对应靶序列的位置，将shRNA分别命名为 CD44 LV
‑
shRNA 592；其基因序列如SEQ ID：NO.1所示：5
’
GCCTTTGAAGGACCAATTACCTTCAAGAGAGGTAATTGGTCCTTCAAAGGC3
’
，其中，TTCAAGAGA为颈环序列；根据慢病毒载体的多克隆位点，在设计的shRNA序列分别添加了酶切位点的粘性末端序列，退火DNA Oligo序列分别：CD44 LV
‑
shRNA 592 S（上游）：5
’
GATCCGCCTTTGAAGGACCAATTACCTTCAAGAGAGGTAATTGGTCCTTCAAAGGCTTTTTG3
’
；CD44 LV
‑
shRNA 592 AS（下游）：5
’
AATTCAAAAAAGCCTTTGAAGGACCAATTACCTCTCTTGAAGGTAATTGGTCCTTCAAAGGC 3
’
；字体加粗表示粘性末端序列，下划线表示颈环序列。
[0012]所有DNA Oligo由生工生物合成。
[0013]为进一步获得带有内切酶粘性末端的双链DNA，将合成的DNA Oligo分别退火，将合成的Oligo用Oligoannealing buffer溶解成100 μM，互补单链各取10 μL与退火Buffer和ddH2O混合，定容至100 μL。然后将Oligo混合物在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑制牛CD44基因表达的shRNA序列，其特征在于序列名称为CD44 LV
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shRNA 592序列，其基因序列如SEQ ID：NO.1所示。2.如权利要求1所述的一种shRNA抑制牛CD44基因表达的shRNA构建于慢病毒载体上，插入shRNA的DNA双链：其特征在于：CD44 LV
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shRNA 592正义链序列为：5
’
GATCCGCCTTTGAAGGACCAATTACCTTCAAGAGAGGTAATTGGTCCTTCAAAGGCTTTTTG3
’
；CD44 LV
‑
shRNA 592反义序列为：5
’
A...

【专利技术属性】
技术研发人员：房希碧，杨润军，刘博群，李晓慧，卢鑫，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：