异源染色体定向转移的方法技术

本发明专利技术提供一种异源染色体定向转移的方法，通过向抗药性基因中人为添加包含loxP序列的功能性内含子，并将其拆分为带有包含loxP序列的重叠区域的两部分，拆分后的两部分抗药性基因分别插入供体物种及受体物种的目标染色体中(两部分抗药性基因在Cre重组酶的作用下发生Cre/loxP位点特异性重组，并回复抗药功能)，并借助异种细胞融合方法实现异源染色体定向转移。本方法可广泛应用于基因功能研究、人类疾病模型构建、治疗性抗体开发及药理药效测试等方面。测试等方面。

【技术实现步骤摘要】
异源染色体定向转移的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体地说，涉及一种异源染色体定向转移的方法。

技术介绍

[0002]转基因技术是指将外源DNA转入动物基因组并产生可遗传修饰的技术，通过该技术产生的稳定携带外源DNA的动物即为转基因动物。当外源DNA包含人类基因组信息时，获得的转基因动物即称为人源化动物。随着基因工程技术的不断发展，人源化动物模型已经逐步实现了从个别碱基或氨基酸到庞大基因簇乃至染色体的人源化。迄今为止，已获得多种可以表达人源基因的人源化动物，这些动物模型被广泛应用于基因功能的研究、人类疾病模型的构建、治疗性抗体的开发、药理药效的测试等方面，强有力地推动了对人类疾病和健康的深入研究(Devoy et al.,2011； Moriwaki et al.,2020；Scheer and Wilson,2016；Zhu et al.,2019)。
[0003]在这些人源化动物模型中，人源化小鼠模型已成为研究人类疾病越来越重要的工具，主要的应用包括免疫球蛋白人源化小鼠模型和唐氏综合症小鼠模型。
[0004]目前较为成熟的免疫球蛋白人源化小鼠模型有HuMab小鼠(Lonberg et al., 1994)、Xeno小鼠(Green et al.,1994)、Tc小鼠(Tomizuka et al.,2000)、VelocImmune 小鼠及Ky小鼠(Lee et al.,2014；Macdonald et al.,2014；Murphy et al.,2014)。相较于鼠源抗体、人鼠嵌合抗体及人源化抗体，由这些免疫球蛋白人源化小鼠模型产生的全人源抗体免疫原性低且临床应用转化成功率高(Carter,2006；Hwang and Foote,2005； Lonberg,2005)，为筛选获得更多治疗性抗体提供了可能。
[0005]唐氏综合症即21三体综合症，又称先天愚型，是由于人21号染色体异常导致的疾病，新生儿中发病率为1/800(Driscoll and Gross,2009)，60％在胎儿时期流产，存活患儿存在面容特殊、智力低下、生长发育畸形的症状(Korenberg et al.,1994)。因唐氏综合症的高致死率和强发育缺陷，构建能够模拟人类疾病的动物模型用于研究疾病发病原因并探究疾病治疗方法势在必行。
[0006]Ts65Dn(Davisson et al.,1990)和Ts1Cje(Sago et al.,1998)均为唐氏小鼠模型，已广泛应用于唐氏综合症发病机制和药物研究，是通过辐射诱导或从自发染色体异常的小鼠中获得的唐氏模型。Tc1模型则是通过辐照微细胞介导的染色体转移法向小鼠胚胎干细胞中转入人源21号染色体获得的，转入的人源染色体游离在小鼠基因组外，但在小鼠体细胞中随机丢失概率为25％(Hernandez et al.,1999)。TcMac21模型则是将人源21号染色体长臂拼接至小鼠着丝粒，构建成在小鼠细胞中更稳定的人工染色体，再通过微细胞介导的染色体转移法转入小鼠胚胎干细胞，该模型未出现体细胞外源染色体丢失的现象(Kazuki et al.,2020)。
[0007]大量研究结果表明，基因组人源化小鼠中人源DNA信息在小鼠转录体系中能够正确地转录表达，但在实现Mb级别基因组人源化的过程中，转基因载体的承载量和基因转移技术受到了极大的挑战(Br
ü
ggemann et al.,1989)。目前常用的基因组人源化技术手段包
括：重组酵母人工染色体(YAC)介导法、细菌人工染色体(BAC)介导连续同源重组法、重组酶介导的基因组置换法(RMGR)和微细胞介导的染色体转移法(MMCT)。
[0008]YAC外源基因的承载量一般为1
‑
2Mb，但其进入受体细胞后是以随机整合的形式整合入受体基因组的，整合位置不仅对小鼠内源基因有着不能提前预测的影响，也可能影响人源基因的表达情况，且YAC构建过程中容易发生载体自身重组事件，其转入外源基因的大小及类别均受到很大的限制(Bellis et al.,1991)。
[0009]MAC对外源基因的承载量符合超大DNA的要求，若要获得包含目标人源DNA的 MAC，需要在目标基因附近进行多次loxP位点的敲入，通过多次Cre/loxP重组最终获得目标MAC。常规的基因转移技术不能实现MAC向受体细胞的转入，最常用的MAC 转移方法是借助微细胞与受体细胞的融合法也就是MMCT技术，但多数人源细胞并不能有效产生微细胞。包含MAC微细胞的产生一般都要借助人源细胞与A9细胞或 CHO细胞融合产生的杂交细胞，MMCT过程涉及一次细胞
‑
细胞融合和一次微细胞
‑ꢀ
细胞融合实验，该过程效率通常为10
‑7‑
10
‑4，且获得的转基因动物中游离于受体基因组的MAC稳定性较差，在人源化小鼠部分组织和器官存在丢失的现象(Kazuki et al., 2004)。
[0010]BAC外源基因的承载量只有300kb，将其与同源重组技术、Cre/loxP重组系统或 piggyBac转座子系统结合可以实现人源基因向特定位点的多次转入，该技术需要进行多次嵌合体及纯合体的制备，非常耗时(Lee et al.,2014；Macdonald et al.,2014)。
[0011]在人鼠异种细胞融合后获得的杂交细胞中人源染色体大量丢失而鼠源染色体倾向于全部保留(Weiss and Green,1967)。已有课题组通过MMCT实验手段将天然人源染色体转移至小鼠胚胎干细胞中，获得免疫球蛋白人源化以及唐氏综合症模型小鼠，但不同人源染色体在小鼠细胞中稳定性不同，存在转染色体小鼠部分组织器官丢失人源染色体的现象。
[0012]现有的基因组人源化技术的操作过程费时费力且效率极低，因此，简化超大人源转基因载体构建过程、提高超大DNA转移效率并保证人源基因转入小鼠细胞和组织后的稳定性，对获得更多基因组人源化动物模型进而筛选更多人类疾病治疗性药物、揭示人类疾病致病机理、研究非编码区功能均具有重要的意义。

技术实现思路

[0013]本专利技术的目的是提供一种异源染色体定向转移的方法。
[0014]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种介导异源染色体定向转移的重组易位筛选系统，包括受体细胞基因编辑载体和供体细胞基因编辑载体。
[0015]其中，所述受体细胞基因编辑载体包含靶向受体细胞染色体近端粒位置的基因编辑器1和Donor DNA 1；所述Donor DNA 1由以下元件组成：启动子
‑
5'抗药性基因
‑ꢀ
包含loxP序列的功能性内含子。
[0016]所述供体细胞基因编辑载体包含靶向供体细胞染色体近着丝粒位置的基因编辑器2和Donor DNA 2；所述Donor DNA 2由以下元件组成：包含loxP序列的功能性内含子
‑
3'抗药性基因
‑
pol本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.介导异源染色体定向转移的重组易位筛选系统，其特征在于，包括受体细胞基因编辑载体和供体细胞基因编辑载体；其中，所述受体细胞基因编辑载体包含靶向受体细胞染色体近端粒位置的基因编辑器1和Donor DNA 1；所述Donor DNA 1由以下元件组成：启动子
‑
5'抗药性基因
‑
包含loxP序列的功能性内含子；所述供体细胞基因编辑载体包含靶向供体细胞染色体近着丝粒位置的基因编辑器2和Donor DNA 2；所述Donor DNA 2由以下元件组成：包含loxP序列的功能性内含子
‑
3'抗药性基因
‑
polyA序列；所述5'抗药性基因和3'抗药性基因是将完整的抗药性基因人为拆分成两部分，拆分后的5'抗药性基因和3'抗药性基因可在Cre重组酶的作用下发生Cre/loxP位点特异性重组，从而回复抗药功能。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，抗药性基因被拆分的位置，遵循RNA剪接原则并参考剪接位点附近的保守序列信息，选择碱基序列为AAGG或CAGG的位点。3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述抗药性基因为neo或puro。4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述功能性内含子为SV40LT内含子，序列如SEQ ID No:1所示。5.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述启...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴森，张丽君，郭紫航，秦毓敏，杜旭光，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：