反义寡核苷酸及其在治疗耳聋-甲状腺肿综合征中的应用制造技术

本发明专利技术涉及医药领域。具体而言，本发明专利技术涉及在前体mRNA剪接过程中防止或减少SLC26A4基因外显子8跳跃的新型反义寡核苷酸，及其在治疗耳聋

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】反义寡核苷酸及其在治疗耳聋
‑
甲状腺肿综合征中的应用
[0001]交叉引用相关申请
[0002]本申请要求于2020年2月12日提交的，申请号为62/975,337的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含一个序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2021年2月10日，命名为13365_0018
‑
00304_SL.txt，大小为16,709字节。


[0005]本专利技术涉及在前体mRNA剪接过程中防止或减少外显子跳跃的新型反义寡核苷酸(“ASOs”)，包含所述ASOs的药物组合物及其用途。

技术介绍

[0006]耳聋
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甲状腺肿(Pendred)综合征是一种感觉神经性听力损失障碍。它是综合征性耳聋最常见的病因之一，约占所有遗传性耳聋病例的4
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10％。Pendred综合征患者具有畸形的内耳，包括扩大的前庭导水管。有时也可以发展出蒙迪尼(Mondini)耳蜗，其中耳蜗和中间隔完全或部分被充满液体的腔取代。虽然由该综合征引起的听力损失通常是先天性的，但一些罕见的病例会在后面的儿童期发展。一些患者(50
‑
83％)还会出现甲状腺肿，尽管这是可变的，因为它取决于其他因素，例如营养摄入。Wemeau和Kopp,(2017)Best Prac.&Res.Clin.Endocrinology&Metabolism 31,213
‑
224。
[0007]Pendred综合征的早期治疗对于先天性病例至关重要，以确保语言的习得和沟通技巧。目前治疗Pendred综合征的选择包括听力支持设备，如助听器，它可以帮助轻度听力障碍。但是对于重度耳聋患者，可能会建议进行人工耳蜗的植入。植入的过程可能会导致具有蒙迪尼耳蜗的患者的脑脊液泄漏。Wemeau和Kopp,(2017)Best Prac.&Res.Clin.Endocrinology&Metabolism 31,213
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224。目前，还没有可用于治疗Pendred综合征的药物，也没有针对Pendred综合征潜在遗传原因的治疗方案。
[0008]Pendred综合征是一种常染色体隐性遗传病，其特征是编码潘特林(pendrin)的SLC26A4基因发生双等位基因突变。Pendrin是一种在内耳和甲状腺中表达的多功能阴离子交换蛋白。由于pendrin对氯离子、碘离子和其他阴离子具有亲和力，它通过促进内耳中氯离子和碳酸氢根的交换来维持内淋巴的成分和电位。Wemeau和Kopp,(2017)Best Prac.&Res.Clin.Endocrinology&Metabolism 31,213
‑
224。SLC26A4基因突变(c.919
‑
2A>G)引起SLC26A4前体mRNA加工过程中的外显子8跳跃。这种突变，也称为IVS7
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2A>G，是东亚听力损失人群中最常见的突变之一。
[0009]在包含编码序列(外显子)和非编码序列(内含子)的真核基因中，非编码的内含子从前体mRNA转录本中被切除，并且编码的外显子拼接在一起形成mRNA。如果在最终的mRNA转录本中保留了内含子或者遗漏了外显子，那么mRNA阅读框可能会在mRNA的翻译过程中被
破坏。这可能会导致产生无功能的多肽序列或者过早出现的终止密码子。可变剪接使得剪接过程进一步复杂化，其中相同的前体mRNA序列可以剪接成不同的外显子组合，形成多个mRNA序列。
[0010]前体mRNA的剪接是一个复杂的过程，该过程涉及一种称为剪接体的多兆道尔顿核糖核蛋白复合物。剪接体识别前体mRNA中的特定序列，以精确切除内含子并连接外显子。剪接体利用三个保守的RNA序列在两个酯交换反应中催化内含子的切除。这些RNA序列是5
′
剪接位点、3
′
剪接位点和分支位点。Will和Luhrmann,(2011)Cold Spring Harb.Perspect.Biol.3,a003707。
[0011]剪接开始于分支位点的2
′
OH基团，其通过亲核攻击与5
′
剪接位点结合，引起5
′
剪接位点的5
′
外显子的剪切并形成套索。然后，5
′
外显子的3
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OH基团攻击3
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剪接位点的3
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外显子，连接5
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外显子和3
′
外显子，并剪切内含子套索。Will和Luhrmann,(2011)Cold Spring Harb.Perspect.Biol 3,a003707。由于剪接过程完全依赖于剪接体识别位点，5
′
和3
′
剪接位点，以及分支位点，这些位点中任何一个的突变都会破坏剪接过程。
[0012]在Pendred综合征中，SLC26A4中的(c.919
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2A>G)突变影响SLC26A4前体mRNA的剪接过程，引起外显子8跳跃。外显子8从最终的mRNA转录本中错误地去除，引起翻译过程中阅读框的中断，从而产生截短和功能异常的pendrin肽。Wemeau和Kopp,(2017)Best Prac.&Res.Clin.Endocrinology&Metabolism 31,213
‑
224。
[0013]ASOs是一类多核苷酸，旨在与靶核苷酸序列特异性结合，从而影响基因表达的一个或多个方面，例如，转录、剪接、稳定性和/或翻译。ASOs可以针对RNA或DNA。针对RNA的ASOs可以与目标mRNA序列结合,从而影响mRNA的稳定性或在核糖体上的翻译。
[0014]与前体mRNA转录本中的靶序列结合的ASOs可以影响剪接过程。在一些情况下，ASOs可用于在前体mRNA剪接过程中诱导外显子跳跃。例如，杜氏肌营养不良症(DMD)是由在翻译过程中改变肌营养不良蛋白(dystrophin)mRNA阅读框的突变引起的，导致过早出现的终止密码子和截短的肌营养不良蛋白。ASOs可以通过在剪接过程中诱导外显子跳跃用来纠正阅读框。移除正确数目的碱基对中的一个外显子会导致更短的mRNA转录体，但是阅读框可能会被纠正。由于肌营养不良蛋白RNA由79个外显子组成，在剪接过程中跳过一个或几个外显子仍然会产生具有部分功能的蛋白质。Shimo等，(2015)Duchenne Muscular Dystrophy143
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155。FDA于2016年批准了一种名为Exondys 51(e本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种长度为10
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30个核苷酸的反义寡核苷酸，其特征在于，包括SEQ ID NO:1(5
′‑
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)的全部或部分。2.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸为：a.HUA0003
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)(SEQ ID NO:10)。3.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸包括非天然主链。4.如权利要求3所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述非天然主链包括修饰的糖基。5.如权利要求4所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述修饰的糖基包括2
′‑
O
‑
甲氧基乙基核糖。6.如权利要求3所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述非天然主链包括修饰的磷酸酯。7.如权利要求6所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述修饰的磷酸酯包括硫代磷酸酯。8.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸包括修饰的含氮碱基。9.如权利要求8所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述修饰的含氮碱基包括5
‑
甲基胞嘧啶碱基。10.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。11.一种在前体mRNA剪接期间防止或减少SLC26A4基因中外显子8跳跃的方法，所述方法包括将核酸分子引入细胞，其特征在于，所述核酸分子为反义寡核苷酸，其包括SEQ ID NO:1(5
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‑3′
)的全部或部分，所述寡核苷酸与所述SLC26A4基因的内含子8靶区域杂交，且其中所述寡核苷酸在所述SLC26A4基因的前体mRNA剪接过程中防止或减少外显子8跳跃。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述反义寡核苷酸为：a.HUA0003
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)(SEQ ID NO:10)。13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细胞是动物细胞。14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞是人类细胞。15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述核酸分子通过表达载体引入细胞。16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述表达载体是pCI
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neo表达载体。17.一种治疗患有Pendred综合征的受试者的听力损失的方法，其特征在于，包括给药治疗有效量的权利要求1所述的反义寡核苷酸。18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述反义寡核苷酸为：a.HUA0003
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【专利技术属性】
技术研发人员：华益民，
申请(专利权)人：苏州安天圣施医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：