基因编辑系统及其在构建TNIP1基因突变的银屑病模型猪核移植供体细胞中的应用技术方案

本发明专利技术公开了基因编辑系统及其在构建TNIP1基因突变的银屑病模型猪核移植供体细胞中的应用。本发明专利技术提供了包括SEQ ID NO：16所示TNIP1

【技术实现步骤摘要】
基因编辑系统及其在构建TNIP1基因突变的银屑病模型猪核移植供体细胞中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体属于基因编辑
，更具体涉及基因编辑系统及其在构建TNIP1基因突变的银屑病模型猪核移植供体细胞中的应用。

技术介绍

[0002]银屑病，又称“白疕”或“牛皮癣”，是一种慢性皮肤疾病，该病的典型临床表现为皮肤出现鳞屑性红斑，严重者可引起致残性银屑病性关节炎，该病严重影响患者的生活，对患者及其家庭造成巨大经济负担。在欧洲和北美人群中，银屑病的发病率为1％
‑
2％，在中国人群中，银屑病患病率虽然仅为0.47％，但由于国内人口基数大，仍有着相对庞大的患病人群。目前尚未有根治银屑病的方法。
[0003]家族聚集性研究证实银屑病能够遗传，且为多基因遗传性疾病。TNFα诱导蛋白3相互作用蛋白1(TNFα
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induced protein 3
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interacting protein 1，TNIP1)基因，为中国汉族和欧美人群所共有的一个银屑病易感基因。TNIPI基因编码的TNIP1蛋白，与TNIP2、TNIP3同属于TNIPs家族，该家族因能与泛素编辑蛋白A20结合、并抑制核转录因子(nuclear factor
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κB，NF
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κB)的转录活性而得名，并因此获得另一个命名ABINs(A20
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binding inhibitor of NF
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κB)。此外，TNIP1还可不依赖于A20和NF
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κB发挥作用，细胞外信号调节酶1/2(ERK 1/2)、视黄酸受体
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α/γ(RAR
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α/γ)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)和CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)等均被证实为TNIP1的靶目标，这些分子被TNIP1激活后可通过多条信号通路发挥不同的生物学作用。
[0004]研究银屑病的发生发展机制及研发相应的药物均需要在动物模型的基础上进行，目前常用的动物模型为小鼠模型，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。猪作为大动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。
[0005]基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供基因编辑系统及其在构建TNIP1基因突变的银屑病模型猪核移植供体细胞中的应用。
[0007]本专利技术提供了一种试剂盒，包括TNIP1
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gRNA2、TNIP1
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gRNA3和NCN蛋白。
[0008]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括TNIP1
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gRNA2、TNIP1
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gRNA3和PRONCN蛋白。
[0009]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括TNIP1
‑
gRNA2、TNIP1
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gRNA3和特异质粒。
[0010]以上任一所述试剂盒还包括猪细胞。
[0011]本专利技术提供了TNIP1
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gRNA2、TNIP1
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gRNA3和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0012]本专利技术还提供了TNIP1
‑
gRNA2、TNIP1
‑
gRNA3和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0013]本专利技术还提供了TNIP1
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gRNA2、TNIP1
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gRNA3和特异质粒在制备试剂盒中的应用。
[0014]以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重猪组细胞；(b)制备银屑病模型猪；(c)制备银屑病细胞模型或银屑病组织模型或银屑病器官模型。
[0015]本专利技术提供了一种制备重组猪细胞的方法，包括如下步骤：将TNIP1
‑
gRNA2、TNIP1
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gRNA3和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组猪细胞。
[0016]所述共转染具体采用电击转染的方式。
[0017]电击转染的参数设置具体可为：1450V、10ms、3pulse。
[0018]所述共转染具体可采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪。
[0019]TNIP1
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gRNA2、TNIP1
‑
gRNA3和NCN蛋白的配比依次为：0.8
‑
1.2μg TNIP1
‑
gRNA2：0.8
‑
1.2μg TNIP1
‑
gRNA3：3
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5μg NCN蛋白。
[0020]TNIP1
‑
gRNA2、TNIP1
‑
gRNA3和NCN蛋白的配比依次为：1μg TNIP1
‑
gRNA2：1μgTNIP1
‑
gRNA3：4μg NCN蛋白。
[0021]猪细胞、TNIP1
‑
gRNA2、TNIP1
‑
gRNA3和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：0.8
‑
1.2μg TNIP1
‑
gRNA2：0.8
‑
1.2μg TNIP1
‑
gRNA3：3
‑
5μg NCN蛋白。
[0022]猪细胞、TNIP1
‑
gRNA2、TNIP1
‑
gRNA3和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：1μgTNIP1
‑
gRNA2：1μg TNIP1
‑
gRNA3：4μg NCN蛋白。
[0023]以上任一所述TNIP1
‑
gRNA2为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3
‑
22位核苷酸所示。
[0024]具体的，所述TNIP1
‑
gRNA2如SEQ ID NO：16所示。
[0025]具体的，所述TNIP1
‑
gRNA2如SEQ ID NO：11所示。
[0026]以上任一所述TNIP1
‑
gRNA3为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：17中第3
‑
22位核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，包括TNIP1
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gRNA2、TNIP1
‑
gRNA3和NCN蛋白；所述TNIP1
‑
gRNA2为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3
‑
22位核苷酸所示；所述TNIP1
‑
gRNA3为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：17中第3
‑
22位核苷酸所示；所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备银屑病模型猪；(c)制备银屑病细胞模型或银屑病组织模型或银屑病器官模型。2.一种试剂盒，包括TNIP1
‑
gRNA2、TNIP1
‑
gRNA3和PRONCN蛋白；TNIP1
‑
gRNA2为权利要求1中所述的TNIP1
‑
gRNA2；TNIP1
‑
gRNA3为权利要求1中所述的TNIP1
‑
gRNA3；所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备银屑病模型猪；(c)制备银屑病细胞模型或银屑病组织模型或银屑病器官模型。3.一种试剂盒，包括TNIP1
‑
gRNA2、TNIP1
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gRNA3和特异质粒；TNIP1
‑
gRNA2为权利要求1中所述的TNIP1
‑
gRNA2；TNIP1
‑
gRNA3为权利要求1中所述的TNIP1
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gRNA3；所述特异质粒自上游至下游依次包括如下元件：启动子、操纵子、核糖体结合位点、PRONCN蛋白的编码基因、终止子；所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备银屑病模型猪；(c)制备银屑病细胞模型或银屑病组织模型或银屑病器官模型。4.TNIP1
‑
gRNA2、TNIP1
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gRNA3和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用；TNIP1
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gRNA2为权利要求1中所述的TNIP1
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gRNA2；TNIP1
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gRNA3为权利要求1中所述的TNIP1
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gRNA3；NCN蛋白为权利要求1中所述的NCN蛋白；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备银屑病模型猪；(c)制备银屑病细胞模型或银屑病组织模型或银屑病器官模型。5.TNIP1
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gRNA2、TNIP1
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gRNA3和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用；TNIP1
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gR...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，马翔，王磊，程锐，方园，赵泽英，胡世芳，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：