一种高产法尼烯的毕赤酵母重组菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种高产法尼烯的毕赤酵母重组菌及其构建方法与应用，本发明专利技术以毕赤酵母菌株X33中代谢改造三个模块的途径来增强α

【技术实现步骤摘要】
一种高产法尼烯的毕赤酵母重组菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种高产法尼烯的毕赤酵母重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]法尼烯是一种无环倍半萜，属于萜类。由于其结构的独特性，它在制药和化妆品行业都有应用，并被视作潜在的理想生物燃料。法尼烯的生产方法有三种，即从植物中提取、化学合成和微生物生产。然而，植物中法尼烯的量很小，很难从植物中提取。同时，化学合成法生产的法尼烯的步骤繁琐，并且具有严重污染环境的特点。因此，微生物生产法尼烯是一种可行的方法，相关研究也在逐渐增加。自然界中有两种法尼烯异构体，即α
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法尼烯和β
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法尼烯，微生物生产β
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法尼烯的研究取得了巨大成功。例如，Meadows等人改写了酿酒酵母中的中心碳代谢途径，以增加乙酰辅酶a的供应，从而获得了β
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法尼烯高产菌株AMR
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5，该菌株在补料分批发酵中产生超过130g/L的β
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法尼烯，产率为2.24g/(L
·
h)，葡萄糖转化效率为17.3％。然而，据我们所知，所报道的菌株在补料分批发酵中产生的最高α
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法尼烯产量不超过0.07g/(g
·
葡萄糖)，这限制了其在工业中的应用。因此，高产高效的α
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法尼烯生产菌株是微生物发酵生产α
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法尼烯的决定性因素之一。
[0003]通过微生物发酵生产α
‑<br/>法尼烯的宿主包括大肠杆菌、解脂耶氏酵母、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母，这些宿主中的α
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法尼烯生物合成途径是明确的。如图1所示，甲羟戊酸(MVA)途径或2
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C
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甲基
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赤藓醇4
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磷酸(MEP)途径生成焦磷酸异戊烯酯(IPP)和焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)，然后将其缩合成α
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法尼烯前体焦磷酸法尼酯(FPP)。MVA途径是古菌和真核生物以及植物和真菌中的主要途径，开始于两个乙酰辅酶A分子的结合，这两个分子由乙酰乙酰辅酶a硫解酶催化。为了增加MVA途径中的碳通量，从而增加α
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法尼烯的产量，已经采取了许多策略，包括过度表达MVA途径的整个基因或关键基因，增加乙酰辅酶A的供应，阻断α
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法尼烯生物合成途径的竞争途径。例如，有研究中过度表达MVA途径中的所有基因，并敲除二酰基甘油二磷酸磷酸酶编码基因dpp1，以增强FPP供应，从而增加酿酒酵母中α
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法尼烯的产量。对于大肠杆菌，有研究者发现MVA途径限速酶IPP异构酶的过度表达增强了IPP和DMAPP的供应，从而增强了α
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法尼烯的产生。此外，通过过表达MVA途径中的关键基因来增强MVA途径的碳通量，也证明有利于提高解脂耶氏酵母中α
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法尼烯的产量。在我们之前的研究中，我们通过细胞质和过氧化物酶体的双重调节构建了α
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法尼烯高产菌株巴斯德毕赤酵母X33
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30，以增强IPP和DMAPP的供应。巴斯德毕赤酵母是一种能够进行许多真核翻译后修饰甲基的营养酵母，是一种极好的宿主系统。在过去几年中，巴斯德毕赤酵母被广泛用作底物细胞，通过代谢途径设计和工程来生产植物衍生的化学品。然而，除了我们团队的报告外，很少有关于修饰巴斯德毕赤酵母以生产α
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法尼烯的报道，其中在使用山梨醇、油酸和异戊二烯作为碳源的过程中，目标菌株毕赤酵母X33
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30在摇瓶中的α
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法尼烯产量达到2.56
±
0.04g/L。山梨醇、油酸和异戊二烯比葡萄糖贵得多，因此如何改造巴斯德毕赤酵母以葡萄糖为碳源，是实现巴斯德毕赤酵母商业化生产α
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法尼烯的关键。
[0004]在多种有效的代谢工程策略中，启动子调控表达也是一种有效的策略。具有合适强度的合适促进剂将有助于巴斯德毕赤酵母高效生产产品。巴斯德毕赤酵母中有许多启动子，包括组成型启动子、诱导型启动子和抑制型启动子。可诱导启动子可大大提高由特定物理或化学因素刺激的靶基因的转录水平，如甲醇诱导启动子P
AOX1
和甲醇/甲胺诱导启动子P
FLD1
。此外，启动子P
G1
和P
G6
是葡萄糖限制诱导型启动子，可以平衡菌株生长和产品生产。组成启动子确保靶基因在宿主中具有稳定的表达水平，例如P
GAP
、P
TEF1
和P
GCW14
。可抑制启动子用于下调基因的表达，因为它们在某些培养条件下被抑制，包括P
MET3
(受蛋氨酸抑制)、P
THR1
(受L
‑
苏氨酸、L
‑
缬氨酸、L
‑
亮氨酸和L
‑
异亮氨酸抑制)，P
SER1
(受L丝氨酸抑制)和P
THI11
(受硫胺抑制)。尽管P
AOX1
因其强大的表达能力和良好的甲醇控制而被广泛用于控制基因表达，但甲醇是一种易燃化学品，并不总是大规模应用的理想原料。因此，优化用于控制α
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法尼烯生物合成途径中基因表达水平的启动子也有利于促进巴斯德毕赤酵母商业化生产α
‑
法尼烯。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术以野生型巴斯德毕赤酵母X33菌株被用作底物细胞，在多维度上进行遗传修饰，以提高α
‑
法尼烯的产量。通过合理调节巴斯德毕赤酵母X33中α
‑
法尼烯生物合成所涉及的关键酶的表达水平以及法尼烯合酶aFS的表达，以加强主要MVA生物合成模块和胞浆乙酰辅酶A供应模块，并削弱FPP分支模块。所得菌株巴斯德毕赤酵母XF22在补料分批发酵168小时后产生17.92
±
1.35g/Lα
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法尼烯，生产力为0.107g/(L
·
h)，产率为0.078g/(g
·
葡萄糖)，这是目前已知的α
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法尼烯生产的最高生产力和产率，表明菌株XF22是生产α
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法尼烯的优势菌株。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种高产α
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法尼烯的毕赤酵母的重组菌，所述的重组菌以毕赤酵母为宿主，异源表达法尼烯合酶(aFS)，过表达了异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)和法尼基二磷酸合酶(ERG20)，并异源表达了截短的羟甲基戊二酸甲酰
‑
CoA还原酶(tHMG1)、乙酰乙酰辅酶A转移酶(AtoB)、乙酰辅酶A合酶(ACS)和丙酮酸脱氢酶系(PDH)，同时敲除了重组菌的二酰基甘油二磷酸磷酸酶基因dpp1，并将角鲨烯合酶基因erg9的启动子替换为P...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产α
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法尼烯的毕赤酵母的重组菌，其特征在于，所述的重组菌以毕赤酵母为宿主，异源表达法尼烯合酶，过表达了异戊烯基二磷酸异构酶和法尼基二磷酸合酶，并异源表达了截短的羟甲基戊二酸甲酰
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CoA还原酶、乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰辅酶A合酶和丙酮酸脱氢酶系，同时敲除了重组菌的二酰基甘油二磷酸磷酸酶基因，并将角鲨烯合酶基因的启动子替换为P
SER1
启动子。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的P
SER1
启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的法尼烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的戊烯基二磷酸异构酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，法尼基二磷酸合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的乙酰辅酶A合酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述的截短的羟甲基戊二酸甲酰
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CoA还原酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述的丙酮酸脱氢酶系是由GeneID为944794的丙酮酸脱氢酶E2亚基aceF、Gene ID为944834的丙酮酸脱氢酶E1亚基aceE和Gene ID为944854的脂肪酰胺脱氢酶lpd三个酶组...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建中，陈胜玲，牛思琪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：