一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母菌的构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种表面展示β

【技术实现步骤摘要】
一种表面展示
β
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半乳糖苷酶的重组毕赤酵母菌的构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及酶的基因工程领域，具体涉及一种表面展示来源于米曲霉的β
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半乳糖苷酶lacA的重组毕赤酵母菌的构建方法与应用。

技术介绍

[0002]表面展示是一种利用锚定蛋白将外源靶蛋白展示在细胞表面的技术。酵母菌株是众所周知的安全性菌株，酵母是真核生物，具有真核细胞蛋白质折叠、mRNA加工、蛋白水解、糖基化和异构化等功能。酵母表面展示技术是通过外源靶蛋白基因与特定的锚定蛋白基因融合形成融合蛋白，连入相关载体并导入酵母细胞，在酵母细胞内蛋白转运机制的引导下将靶蛋白表达定位于酵母细胞表面。通常选择细胞壁外层的甘露糖蛋白充当锚定蛋白，外源靶蛋白和锚定蛋白主要有两种融合方式：C端融合和N端融合。用锚定蛋白将外源蛋白展示在细胞表面，稳定性良好。β
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半乳糖苷酶在医学、食品等方面应用广泛，毕赤酵母表面展示系统有良好的发展前景，用锚定蛋白将来源于米曲霉的β
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半乳糖苷酶lacA展示在毕赤酵母细胞表面，其展示的酶比较稳定，适合充当全细胞催化剂，近些年来对毕赤酵母表面展示系统的研究越来越多。

技术实现思路

[0003]针对现有技术存在的问题，本专利技术实际要解决的技术问题是提供一种表面展示β
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半乳糖苷酶的重组毕赤酵母菌。
[0004]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述重组毕赤酵母菌的构建方法。
[0005]本专利技术进一步要解决的技术问题是提供上述重组毕赤酵母的诱导表达方法。
[0006]本专利技术进一步要解决的技术问题是提供上述重组毕赤酵母发酵产低聚半乳糖中的应用。
[0007]专利技术思路：本专利技术旨在通过酵母表面展示技术将来源于米曲霉BK03的β
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半乳糖苷酶lacA基因展示表达在原始毕赤酵母Pichia pastoris GS115细胞表面，获得一株能够合成低聚半乳糖的重组毕赤酵母菌株。通过对重组菌株固定化细胞固定化酶的研究，测定酶活和产量变化，获得一株高产低聚半乳糖的毕赤酵母表面展示菌株。
[0008]为了解决上述第一个技术问题，本专利技术公开了一种表面展示β
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半乳糖苷酶的重组毕赤酵母菌，在原始毕赤酵母Pichia pastoris GS115中异源表达来源于米曲霉BK03的β
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半乳糖苷酶基因lacA与来源于酿酒酵母的细胞壁蛋白Flo1p。
[0009]其中，所述β
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半乳糖苷酶基因lacA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0010]其中，所述细胞壁蛋白Flo1p的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0011]为了解决上述第二个技术问题，本专利技术公开了上述重组毕赤酵母菌的构建方法，在原始毕赤酵母Pichia pastoris GS115中导入携带Flo1p和lacA的重组质粒pPIC9k
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Flo1p
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lacA。
[0012]具体地，所述毕赤酵母表面展示β
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半乳糖苷酶lacA重组毕赤酵母菌的构建方法包括如下步骤：
[0013](1)以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的基因组为模板构建锚定蛋白Flo1p的表面展示表达原件；
[0014](2)使用分子生物学方法，将实验室已构建好的重组质粒pPIC9k
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Pir1p
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lacA酶切，去除Pir1p基因片段，获得线性化质粒pPIC9k
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lacA；然后酶切FS片段(此处FS是Flo1p的N端部分片段)；用T4连接酶将酶切后的FS连接到pPIC9k
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lacA上，其中lacA基因的终止密码子前面包含一个FLAG标签，Flo1p和lacA基因之间包含一个Linker，得到携带flo1p和lacA基因的pPIC9k重组质粒pPIC9K
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Flo1p
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lacA；
[0015](3)将重组质粒pPIC9k
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Flo1p
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lacA电转到毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)基因组上，获得重组表达菌株GS115
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Flo1p
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lacA；
[0016]其中，重组质粒pPIC9K
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lacA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0017]其中，重组质粒pPIC9k
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Pir1p
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lacA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0018]其中，所述重组质粒pPIC9k
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Flo1p
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lacA核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0019]构建完成后，检测β
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半乳糖苷酶lacA是否锚定在细胞表面；并测定表面展示的β
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半乳糖苷酶的酶活。
[0020]为了解决上述第三个技术问题，本专利技术公开了上述重组毕赤酵母的诱导表达方法，所述方法包括以下步骤：
[0021](1)将所述重组毕赤酵母菌的种子液接种到BMGY培养基中培养至OD600为2～6；
[0022](2)将步骤(1)培养好的BMGY离心，所得沉淀接种到BMMY培养基中发酵，加入甲醇诱导培养。
[0023]为了解决上述第四个技术问题，本专利技术公开了上述表面展示β
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半乳糖苷酶的重组毕赤酵母菌在发酵产低聚半乳糖中的应用。
[0024]所述应用为，将所述重组毕赤酵母接种于毕赤酵母发酵培养基中发酵培养，离心收集菌体，然后以乳糖为底物进行细胞转化，得到低聚半乳糖，具体包括如下步骤：
[0025](1)将所述重组毕赤酵母菌的种子液接种到BMGY培养基中培养至OD600为2～6；
[0026](2)将步骤(1)培养好的BMGY离心，所得沉淀接种到BMMY培养基中发酵，加入甲醇诱导培养；发酵结束后，离心收集菌体；
[0027](3)以乳糖作为底物，将步骤(2)所得菌体进行转化培养，即得含有低聚半乳糖的反应液。
[0028]上述第三个技术问题和第四个技术问题中：
[0029]步骤(1)中，所述BMGY培养基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、100mL/L磷酸钾母液、2mL/L生物素母液、100mL/L 10％甘油、100mL/L YNB母液，溶剂为纯水。
[0030]步骤(2)中，所述BMMY培养基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、100mL/L磷酸钾母液、2mL/L生物素母液、100mL/L YNB母液、5mL/L甲醇，溶剂为纯水。
[0031]其中，所述YNB母液为20.1g YNB+150ml H2O；所述磷酸钾母液为0.45g K2HPO4+1.77g 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表面展示β
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半乳糖苷酶的重组毕赤酵母菌，其特征在于，在原始毕赤酵母Pichia pastoris GS115中异源表达来源于米曲霉BK03的β
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半乳糖苷酶基因lacA与来源于酿酒酵母的细胞壁蛋白Flo1p。2.根据权利要求1所述重组毕赤酵母菌，其特征在于，所述β
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半乳糖苷酶基因lacA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。3.根据权利要求1所述重组毕赤酵母菌，其特征在于，所述细胞壁蛋白Flo1p的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。4.权利要求1所述重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，在原始毕赤酵母Pichia pastoris GS115中导入携带Flo1p和lacA的重组质粒pPIC9k
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Flo1p
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lacA。5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述重组质粒pPIC9k
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Flo1p
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lacA核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。6.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，王斯楠，应汉杰，余斌，王诗萌，陈天鹏，孙文俊，朱家庆，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：