生产10-羟基硬脂酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供生产10

【技术实现步骤摘要】
生产10
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羟基硬脂酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于代谢工程、基因工程和发酵工程
，具体地说，涉及生产10
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羟基硬脂酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]燃料和化学品使用需求的增长导致了油料作物产量的增加，并引起了人们对油料种子生产的可持续性和环境影响的关注，这损害了生物多样性，并导致了其他生态问题。随着代谢工程和合成生物学技术的不断完善，微生物细胞工厂作为一种生产可再生生物基产品的环保工艺，受到越来越多的关注，该生产方式不仅能够有效避免化学生产方式过程中需要的高温、高压等苛刻条件，而且解决了产品生产过程中无法控制的立体对映性问题。
[0003]酿酒酵母作为一种安全的模式真核生物，不仅具有生长周期短、容易培养、对苛刻的工业反应条件具有很高的耐受性等优点，而且其生产不受季节和原料供应的限制，在多种天然产物的合成中发挥了巨大的优势，包括脂肪酸衍生物、类异戊二烯、生物碱和多酮类化合物等生物的合成，已广泛应用于食品、医药、工业产品等领域。
[0004]羟基脂肪酸是重要的脂肪酸衍生物，广泛用于表面活性剂、润滑剂、化妆品、抗菌剂、医药中间体。虽然在性质上已确定了大量的羟基脂肪酸，但目前只有很少种类的羟基脂肪酸应用于工业化生产。10
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羟基硬脂酸(10
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hydroxystearic acid,10
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HSA)作为一种工业用途的化学物质，不仅可以用作润滑剂成分，而且是生产具有黄油风味香料γ
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十二内酯的前体。由于在化学合成过程中温度的影响，会产生异构体混合物，大大降低了产品中10
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HSA的纯度，限制了其应用范围。目前报道的微生物产10
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HSA研究中，主要利用大肠杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、谷氨酸棒杆菌等原核生物在水合酶的作用下，通过转化油酸来生产10
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HSA，但是高浓度的油酸也会抑制菌体的生长，降低其生产效率。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了生产10
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羟基硬脂酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。本专利技术以葡萄糖为底物，利用酿酒酵母生产10
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HSA，提供了一种绿色可持续的10
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HSA廉价生产方式。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供生产10
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羟基硬脂酸的酿酒酵母工程菌，提高酿酒酵母中FAD辅因子的表达量；和/或，在酿酒酵母中表达FAD依赖型水合酶。
[0007]作为优选，所述提高酿酒酵母中FAD辅因子的表达量是在酿酒酵母中FAD1基因；
[0008]所述在酿酒酵母中表达FAD依赖型水合酶是在酿酒酵母中表达EmFAH10蛋白；
[0009]所述FAD1基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.8；
[0010]所述EmFAH10蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3。
[0011]作为优选，所述酿酒酵母为酿酒酵母整合菌株；所述酿酒酵母整合菌株是将含有编码转运蛋白基因的质粒整合到酿酒酵母GL1染色体XI2位点上，得到酿酒酵母整合菌株；所述转运蛋白为PkFAT或PcFAT；优选所述转运蛋白为PkFAT。
[0012]本专利技术的第二个目的是提供生产10
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羟基硬脂酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，将编码脂肪酸水合酶基因构建到质粒上，然后将重组质粒导入酿酒酵母中；
[0013]所述脂肪酸水合酶为SmFAH10、EmFAH10或PaFAH10，优选所述脂肪酸水合酶为EmFAH10；
[0014]所述SmFAH10蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2；
[0015]所述EmFAH10蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3；
[0016]所述PaFAH10蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.5。
[0017]作为优选，所述质粒为pOH，所述pOH的构建方法为：以质粒PRS426为载体，用KpnI和HindIII双酶切，胶回收获得载体片段；以质粒Y33
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PGKCYC为模板，以426
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PGK
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F和426
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CYC
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R为引物进行PCR扩增，胶回收后获得基因片段；最后将基因片段和载体片段同源连接，获得质粒pOH；
[0018]所述426
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PGK
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F为：aggaattcgatatcaagcttTATTTTAGATTCCTGACTTCAACTCAAG
[0019]所述426
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CYC
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R为：tatagggcgaattgggtaccGCAAATTAAAGCCTTCGAGCG。
[0020]作为优选，将脂肪酸水合酶基因和FAD1基因构建到同一质粒上，然后将重组质粒导入酿酒酵母GL1中。
[0021]作为优选，所述质粒为pOH或PUGG1；优选所述质粒为PUGG1；
[0022]所述质粒为pOH，所述pOH的构建方法为：以质粒PRS426为载体，用KpnI和HindIII双酶切，胶回收获得载体片段；以质粒Y33
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PGKCYC为模板，以426
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PGK
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F和426
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CYC
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R为引物进行PCR扩增，胶回收后获得基因片段；最后将基因片段和载体片段同源连接，获得质粒pOH；
[0023]所述426
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PGK
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F为：aggaattcgatatcaagcttTATTTTAGATTCCTGACTTCAACTCAAG
[0024]所述426
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CYC
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R为：tatagggcgaattgggtaccGCAAATTAAAGCCTTCGAGCG。
[0025]作为优选，将脂肪酸水合酶基因和FAD1基因构建到同一质粒上，然后将重组质粒导入酿酒酵母整合菌株中；
[0026]所述酿酒酵母整合菌株是将含有编码转运蛋白基因的质粒整合到酿酒酵母GL1染色体XI2位点上，得到酿酒酵母整合菌株；所述转运蛋白为PkFAT或PcFAT；优选所述转运蛋白为PkFAT；
[0027]所述转运蛋白PkFAT的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.12；
[0028]所述转运蛋白PcFAT的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.13。
[0029]本专利技术的第三个目的是提供上述的酿酒酵母工程菌，或应用上述的方法制备的酿酒酵母工程菌在发酵生产10
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羟基硬脂酸中的应用。
[0030]本专利技术的第四个目的是提供一种发酵生产10
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羟基硬脂酸的方法，将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.生产10
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羟基硬脂酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于：提高酿酒酵母中FAD辅因子的表达量；和/或，在酿酒酵母中表达FAD依赖型水合酶。2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述提高酿酒酵母中FAD辅因子的表达量是在酿酒酵母中表达FAD1基因；所述在酿酒酵母中表达FAD依赖型水合酶是在酿酒酵母中表达EmFAH10蛋白；所述FAD1基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.8；所述EmFAH10蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3。3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述酿酒酵母为酿酒酵母整合菌株；所述酿酒酵母整合菌株是将含有编码转运蛋白基因的质粒整合到酿酒酵母GL1染色体XI2位点上，得到酿酒酵母整合菌株；所述转运蛋白为PkFAT或PcFAT；优选所述转运蛋白为PkFAT。4.生产10
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羟基硬脂酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：将编码脂肪酸水合酶基因构建到质粒上，然后将重组质粒导入酿酒酵母中；所述脂肪酸水合酶为SmFAH10、EmFAH10或PaFAH10，优选所述脂肪酸水合酶为EmFAH10；所述SmFAH10蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2；所述EmFAH10蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3；所述PaFAH10蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.5。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述质粒为pOH，所述pOH的构建方法为：以质粒PRS426为载体，用KpnI和HindIII双酶切，胶回收获得载体片段；以质粒Y33
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PGKCYC为模板，以426
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PGK
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F和426
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CYC
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R为引物进行PCR扩增，胶回收后获得基因片段；最后将基因片段和载体片段同源连接，获得质粒pOH；所述426
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PGK
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F为：aggaattcgatatcaagcttTATTTTAGATTCCTGACTTCAACTCAAG所述426
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CYC
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R为：tatagggcgaattgggtaccGCAAATTAAAGCCTTCGAGCG。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：史硕博，董跟来，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：