一种重组解脂耶氏酵母菌及其在生产赤藓糖醇中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组解脂耶氏酵母菌及其在生产赤藓糖醇中的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术所述重组解脂耶氏酵母基因组中Ku70基因已缺失，并且运用质粒pINA1269组合过表达了GUT1、GUT2、TKL1和TAL1基因。本发明专利技术提供了一种可高产赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母Y

【技术实现步骤摘要】
一种重组解脂耶氏酵母菌及其在生产赤藓糖醇中的应用


[0001]本专利技术涉及一种重组解脂耶氏酵母菌及其在生产赤藓糖醇中的应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]赤藓糖醇，又名1,2,3,4
‑
丁四醇，是一种具有甜味的四碳糖醇，天然存在于海藻、真菌、水果和发酵食品中。临床研究和动物毒理学试验发现，赤藓糖醇在人体内不被代谢，摄取的赤藓糖醇90％通过肾脏过程排泄。由于赤藓糖醇特殊的营养特性，近年来被广泛应用于食品和医药等领域。赤藓糖醇主要有以下几个方面：(1)增加食物甜度。赤藓糖醇是一种甜味剂，甜度是蔗糖的60％
‑
70％，入口有清凉的甜味，一般加入蛋糕、糖果、饮料等食品中使用。(2)帮助减肥。赤藓糖醇虽然甜，但是没有热量，是天然零热量的甜味剂，对于蛋糕类产品，添加赤藓糖醇可以至少减少30％的热量，并且使用后不会带来负面的影响，吃后可帮助减肥，非常适合想要瘦身的人群替代糖食用。(3)保护口腔。很多人吃糖担心会龋齿，而赤藓糖醇这种代糖不会被口腔细菌所利用，因此不会造成牙齿损伤，还能减少口腔细菌滋生，有效保护口腔健康。
[0003]目前，赤藓糖醇的生产方法主要有微生物发酵法和化学合成法。化学合成法主要是用酸碱处理经高碘酸氧化过的淀粉或纤维素，高温高压下加氢还原获得，但产物中副产物较多，收率低，产物较难分离，难以实现工业化。相对于化学合成法制备赤藓糖醇，微生物发酵法生产过程温和易控制、环境污染少、产品安全，更具有生产优势。因此，目前常利用微生物发酵法生产赤藓糖醇。
[0004]Huiling等人过表达分离出编码两种新型赤藓糖还原酶(ER)的基因g141.t1(YALI0D07634g)和g3023.t1(YALI0C13508g)导致赤藓糖醇产量平均提高14.7％，生产力提高31.2％。并通过分别过表达编码葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶和6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因ZWF1和GND1来平衡NADPH辅因子代谢，使得赤藓糖醇产量提高5％，生产力提高50％(具体可见参考文献：Huiling,C.,Siqi,W.,Muhammad,B.,Xuemei,G.,Can,Z.,Patrick,F.,Hairong,C.,2018.Identification,characterization of two NADPH
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dependent erythrose reductases in the yeast Yarrowia lipolytica and improvement of erythritol productivity using metabolic engineering.Microb Cell Fact.17,133.)，但是目前只有少数以甘油为碳源来生产赤藓糖醇，尤其是粗甘油。

技术实现思路

[0005]为提高现有技术当中的赤藓糖醇的生产菌株的产量及产率，以及实现生物柴油的废弃物粗甘油的重新利用，本专利技术提供了一种重组解脂耶氏酵母。
[0006]所述生物柴油的废弃物粗甘油主要成分为(w/w)：甘油80
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85％，钠盐2.0％，甲醇10～15％，其他有机物2.5％和水2％。
[0007]本专利技术提供了一种重组解脂耶氏酵母，所述重组解脂耶氏酵母菌为，敲除了出发
菌株解脂耶氏酵母菌的Ku70基因，同时过表达了来源于解脂耶氏酵母菌的甘油激酶基因GUT1、3
‑
磷酸甘油醛脱氢酶基因GUT2、转酮酶基因TKL1和转醛酶基因TAL1。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述Ku70基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白，所述Ku70基因的NCBI Genebank登录号为：2910012。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述甘油激酶基因GUT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白，所述甘油激酶的基因GUT1的NCBI Genebank登录号为：2908247。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述3
‑
磷酸甘油醛脱氢酶基因GUT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的蛋白，所述3
‑
磷酸甘油醛脱氢酶的基因GUT2的NCBI Genebank登录号为：2907009。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述转酮酶基因TKL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的蛋白，所述转酮酶的基因TKL1的NCBI Genebank登录号为：2912397。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述转醛酶基因TAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的蛋白，所述转醛酶的基因TAL1的NCBI Genebank登录号为：2909043。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组解脂耶氏酵母以pCAS1yl质粒或pINA1269质粒为表达载体。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述pCAS1yl质粒表达载体购自Addgene。
[0015]所述pINA1269质粒表达载体由法国教授Catherine Madzak赠送，该表达载体的制备方法公开于“Madzak C,Gaillardin C,Beckerich J M.Heterologous protein expression and secretion in the non
‑
conventional yeast Yarrowia lipolytica:a review[J].Journal of Biotechnology,2004,109(1
‑
2):63
‑
81.”论文中，也可购自：BioVector NTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心，NTCC典型培养物保藏中心。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组解脂耶氏酵母菌是以Yarrowia lipolytica PO1f为出发菌株。
[0017]本专利技术还提供了构建上述重组解脂耶氏酵母的方法，所述方法包括以下步骤：
[0018](1)运用pCAS1yl在出发菌株解脂耶氏酵母中首先敲除Ku70基因获得菌株Y.lipolytica PO1f
‑
ΔKu70；
[0019](2)以pINA1269质粒过表达甘油激酶基因GUT1、3
‑
磷酸甘油醛脱氢酶基因GUT2、转酮酶基因TKL1和转醛酶基因TAL1，制备得到重组质粒pINA1269
‑
GUT1
‑
TKL1
‑
GUT2
‑
TAL1；
[0020](3)将制备得到的重组质粒pINA1269
‑
GUT1
‑
TKL1
‑
GUT2
‑
TAL1导入步骤(1)得到的菌株中，制备得到重组解脂耶氏酵母/pINA1269...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌为，敲除了出发菌株解脂耶氏酵母菌的Ku70基因，同时过表达了来源于解脂耶氏酵母菌的甘油激酶基因GUT1、3
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磷酸甘油醛脱氢酶基因GUT2、转酮酶基因TKL1和转醛酶基因TAL1。2.如权利要求1所述的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌是以Yarrowia lipolytica PO1f为出发菌株。3.如权利要求2所述的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌采用pCAS1yl质粒和/或pINA1269质粒为表达载体。4.如权利要求1～3任一所述的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述Ku70基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白，所述甘油激酶基因GUT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白，所述3
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磷酸甘油醛脱氢酶基因GUT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的蛋白，所述转酮酶基因TKL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的蛋白，所述转醛酶基因TAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的蛋白。5.一种制备权利要求1～4任一所述的重组解脂耶氏酵母菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)以pCAS1yl质粒敲除出发菌株解脂耶氏酵母菌基因组上的Ku70基因；(2)以pINA1269质粒过表达甘油激酶基因GUT1、3
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磷酸甘油醛脱氢酶基因GUT2、转酮酶基因TKL1和转醛酶基因TAL1，制备得到重组质粒pINA1269
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GUT1
‑
TKL1

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，杨树玲，徐美娟，杨套伟，张显，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：