一种间接表面展示PETase蛋白的重组毕赤酵母制造技术

本发明专利技术公开了一种间接表面展示PETase蛋白的重组毕赤酵母，包括：(1)在毕赤酵母GS115中异源表达3

【技术实现步骤摘要】
一种间接表面展示PETase蛋白的重组毕赤酵母


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种间接表面展示PETase蛋白的重组毕赤酵母。

技术介绍

[0002]PET是一种被广泛应用的高分子芳香族聚酯，由对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)通过酯键相连构成。2015年，全球PET产量达到约2780万吨，主要制造包装材料和饮料瓶。PET具有优良的综合性能，如质轻、强度大、耐高低温、耐化学腐蚀、绝缘性好、透明度高。然而PET强劲需求在带来便利的同时也产生了一个全球性的问题：如何有效地处理消费后的PET或由于其耐用性而可以在环境中积累并停留数百年的PET废弃物？多项研究表明，已发现超过690种海洋生物在其体内积累了PET碎片和微塑料，这意味着PET已经在人类食物中广泛传播。
[0003]目前，已经开发了多种策略来回收使用过的PET，包括化学、物理和生物处理。近年来，生物回收塑料废弃物因其作用条件比较温和环保、安全性较高而备受关注，将有望发展成为塑料降解的方法之一。生物解聚和转化技术是在温和条件下使用微生物/酶选择性将废塑料解聚成不同的聚合物单体，以及对混合塑料降解物进行高值化的生物炼制过程。塑料是人工合成的高分子材料，在设计之初就具备结构致密、疏水性强、分子结晶度高、键能稳定等特点，因此，传统认为无论是微生物还是酶都难以将塑料聚合物高效降解。然而，随着近些年在塑料生物降解领域，特别是PET塑料的酶法降解领域取得的突破性进展，让人们对塑料生物降解有了全新的认识。
[0004]聚对苯二甲酸乙二醇酯降解酶(PETase)能将PET降解为单(2
‑
羟乙基)对苯二甲酸或对苯二甲酸,其最大的优势是,与其他能降解PET的真菌中的酶LCC、TfH、FsC相比,其在中温段(30
‑
40℃)的酶活显著高于其他酶,这意味着在实际应用中较容易达到适宜的反应条件。
[0005]酵母表面展示酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现存储稳定性高，分离回收容易，连续操作可控，工艺简便等优点，并且使用间接表面展示系统，可以提高PETase在酵母表面的蛋白展示量，但目前尚未有细胞表面间接展示PETase的报道。因此，构建PETase的间接表面展示菌株进行PET的转化具有很大的实际意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种重组毕赤酵母。
[0007]本专利技术还要解决技术问题是提供上述重组毕赤酵母的构建方法。
[0008]本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述重组毕赤酵母在间接表面展示PETase蛋白中的应用。
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0010]一种间接表面展示PETase蛋白的重组毕赤酵母，将IM7酵母和CL7
‑
PETase蛋白结合构建得到的。
[0011]其中，所述的IM7酵母是以毕赤酵母为宿主，异源表达3
×
IM7
‑
SED1融合蛋白后培养得到的。
[0012]其中，所述的CL7
‑
PETase蛋白是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，异源表达CL7
‑
PETase融合蛋白后培养得到的。
[0013]其中，所述的毕赤酵母为毕赤酵母菌Pichia pastoris GS115(购买自碧云天生物技术有限公司)。
[0014]上述重组毕赤酵母的构建方法，包括如下步骤：
[0015](1)IM7酵母的构建：
[0016](1a)重组质粒的构建与转化：将构建的重组质粒pPICZαA
‑
HA
‑3×
IM7
‑
SED1(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)通过电转化方法转入毕赤酵母GS115中，得到重组菌IM7蛋白表面展示菌株；
[0017](1b)将步骤(1a)得到的重组菌IM7蛋白表面展示菌株接种培养并进行诱导产酶，锚定蛋白SED1会将所连接的IM7蛋白固定在酵母表面，得到表面固定了IM7的IM7酵母。
[0018](2)CL7
‑
PETase蛋白的构建：
[0019](2a)重组质粒的构建与转化：将重组质粒pET
‑
22b
‑
CL7
‑
PETase(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌CL7
‑
PETase蛋白表达菌株；
[0020](2b)将步骤(2a)得到的重组菌CL7
‑
PETase蛋白表达菌株接种培养并进行诱导产酶，得到CL7
‑
PETase蛋白。
[0021](3)将步骤(1b)得到的IM7酵母和步骤(2b)得到的CL7
‑
PETase蛋白结合，构建重组毕赤酵母。
[0022]其中，步骤(1a)中，所述的IM7蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的SED1蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0023]其中，步骤(1a)中，所述的电转化方法为：将质粒pPICZαA
‑
HA
‑3×
IM7
‑
SED1使用sacⅠ酶切割成线性化质粒并回收。取出制备好的毕赤酵母GS115感受态细胞，加入1
‑
3μg线性化质粒，轻轻混匀后放置冰上5min再转移至0.2cm的电转杯中。设置电转仪的参数为：电压1.5kV，电阻250Ω，电容25μF，进行电转。电转后立刻向电转杯中加入1mL预冷的山梨醇，然后转入1.5mL离心管中，放置在30℃培养箱中静置培养1h。培养结束后在室温下4000rpm离心3min，弃上清，菌体用YPDS培养基重悬，然后涂布在含有100μg/mL博莱霉素的YPD平板上，放置在30℃培养箱中培养48h。
[0024]其中，步骤(1b)中，所述的重组菌IM7蛋白表面展示菌株接种培养，其接种培养条件为：将重组菌IM7蛋白表面展示菌株接种在YPD培养基中，加入100μg/mL的博莱霉素，在30℃培养24h后，将菌液按照1％v/v的接种量加入到BMGY液体培养基中30℃培养24h后，将菌液装入无菌离心管中6000rpm离心10min后，弃上清，用等体积的BMMY液体培养基重悬菌体后转入摇瓶中放置在30℃摇床中培养，每隔24h补加1％v/v的甲醇，发酵五天后，离心收集菌体，得到IM7酵母。
[0025]其中，步骤(2a)中，所述的CL7蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述的
PETase蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0026]其中，步骤(2a)中，所述的转化，是将1μg质粒pET
‑
22b
‑
CL7
‑
PETase加入到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间接表面展示PETase蛋白的重组毕赤酵母，其特征在于，将IM7酵母和CL7
‑
PETase蛋白结合构建得到的，其中，所述的IM7酵母是以毕赤酵母为宿主，异源表达3
×
IM7
‑
SED1融合蛋白后培养得到的；其中，所述的CL7
‑
PETase蛋白是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，异源表达CL7
‑
PETase融合蛋白后培养得到的。2.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述的毕赤酵母为毕赤酵母菌Pichia pastoris GS115。3.权利要求1所述的重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)IM7酵母的构建：(1a)重组质粒的构建与转化：将构建的重组质粒pPICZαA
‑
HA
‑3×
IM7
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SED1通过电转化方法转入毕赤酵母GS115中，得到重组菌IM7蛋白表面展示菌株；(1b)将步骤(1a)得到的重组菌IM7蛋白表面展示菌株接种培养并进行诱导产酶，锚定蛋白SED1会将所连接的IM7蛋白固定在酵母表面，得到表面固定了IM7的IM7酵母。(2)CL7
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PETase蛋白的构建：(2a)重组质粒的构建与转化：将重组质粒pET
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22b
‑
CL7
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PETase转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌CL7
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PETase蛋白表达菌株；(2b)将步骤(2a)得到的重组菌CL7
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PETase蛋白表达菌株接种培养并进行诱导产酶，得到CL7
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PETase蛋白。(3)将步骤(1b)得到的IM7酵母和步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：董维亮，荣欢，姜岷，刘嘉唯，周杰，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：