一种双向筛选相互作用的TCR和pMHC的方法技术

本发明专利技术涉及一种双向筛选相互作用的TCR和pMHC的方法，通过本发明专利技术所提供的方法，利用酵母展示技术与酵母交配系统，在酵母表面分别展示TCR文库、pMHC抗原文库，进而通过二倍体筛选和测序实现TCR和pMHC抗原序列的双向筛选。根据本发明专利技术所提供的方法，无需以往技术中耗时费力的纯化蛋白的步骤，可在短时间内双向筛选得到相互作用的特定TCR序列和特定pMHC抗原序列，且实验结果可靠。且实验结果可靠。且实验结果可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种双向筛选相互作用的TCR和pMHC的方法


[0001]本专利技术涉及一种双向筛选相互作用的TCR和pMHC的方法，通过本专利技术所提供的方法，利用酵母展示技术与酵母交配系统，在酵母表面分别展示TCR文库、pMHC抗原文库，进而通过二倍体筛选和测序实现TCR和pMHC抗原序列的双向筛选。根据本专利技术所提供的方法，无需以往技术中耗时费力的纯化蛋白的步骤，可在短时间内双向筛选得到相互作用的特定TCR序列和特定pMHC抗原序列，且实验结果可靠。

技术介绍

[0002]TCR(T cell receptors，TCR)是T细胞表面的特异性T细胞受体，是一种能够识别内/外源性抗原的分子，可以实现对特定受损伤细胞的杀伤和清除，同时可以介导免疫应答，在免疫应答和免疫调节中发挥着重要的作用。适应性免疫系统中，在T细胞识别抗原的过程中，受体TCR和主要组织相容性复合体(Major Histocompatibilty Complex,MHC)提呈的抗原分子多肽(pMHC或抗原
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MHC复合物)之间密切结合，从而激活T细胞，即T细胞受到抗原刺激后，分化、增殖、转化为活化的T细胞，产生对抗原的直接杀伤作用及活化T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用的免疫效应。肿瘤细胞免疫疗法(TCR
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T)疗法就是利用与目标肿瘤抗原特异性结合的T细胞，从而实现杀伤、清除肿瘤细胞的治疗方法。
[0003]TCR识别pMHC激活免疫应答对于维持人体的健康至关重要，因此，生物学领域中对于TCR和pMHC相互作用强度的研究也一直是热点之一。目前研究方法主要有以下三种：
[0004]第一种方法是借助1996年美国John D.Altman等人(Phenotypic Analysis of Antigen
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Specific T Lymphocytes.Science 274,94
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96(1996).)开发出的抗原
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MHC复合物四聚体(简称：MHC四聚体)技术，一个MHC四聚体分子可与同一T细胞表面的3
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4个TCR相识别并结合，从而大大增强了抗原
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MHC复合物与TCR之间的结合力和检测特异性，并可通过流式细胞术成功实现对抗原特异性的T细胞的离体分析。通过该方式可以筛选与该MHC四聚体相互作用的TCR序列。在此基础上，Toebes等人于2006年进一步提出UV
‑
诱导快速替换抗原肽技术(Toebes,M.,Coccoris,M.,Bins,A.,Rodenko,B.,Gomez,R.,Nieuwkoop,N.J.,Kasteele,W.van de,Rimmelzwaan,G.F.,Haanen,J.B.A.G.,Ovaa,H.,et al.(2006).Design and use of conditional MHC class I ligands.Nat.Med.12,246
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251.)，该技术直接通过UV替换实现新的抗原肽与MHC蛋白的组装，简化了pMHC四聚体的构建过程。Hadrup等人于2009年提出一种多色荧光编码技术(Hadrup,S.R.,Bakker,A.H.,Shu,C.J.,Andersen,R.S.,Veluw,J.van,Hombrink,P.,Castermans,E.,Straten,P.thor,Blank,C.,Haanen,J.B.,et al.(2009).Parallel detection of antigen
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specific T
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cell responses by multidimensional encoding of MHC multimers.Nat.Methods 6,520
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526.)，该技术通过不用的荧光基团编码不同的pMHC蛋白，能够实现在一次流式细胞实验中检测到TCR与多个抗原的相互作用，该技术可以同时检测15个抗原的T细胞免疫反应。Bentzen等人于2016年开发了DNA条形码(DNA barcode)标记MHC多聚体的技术(Bentzen,A.K.,Marquard,A.M.,Lyngaa,R.,Saini,S.K.,Ramskov,S.,Donia,M.,Such,L.,Furness,
complexes.Science 359,1037
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1042.；Wen,F.,Sethi,D.K.,Wucherpfennig,K.W.,and Zhao,H.(2011).Cell surface display of functional human MHC class II proteins:yeast display versus insect cell display.Protein Eng.Des.Sel.24,701.)或者筛选与特定TCR结合的肽段序列(Gee,M.H.,Han,A.,Lofgren,S.M.,Beausang,J.F.,Mendoza,J.L.,Birnbaum,M.E.,Bethune,M.T.,Fischer,S.,Yang,X.,Gomez
‑
Eerland,R.,et al.(2018).Antigen Identification for Orphan T Cell Receptors Expressed on Tumor
‑
Infiltrating Lymphocytes.Cell 172,549
‑
563.e16.；Wen,F.,Sethi,D.K.,Wucherpfennig,K.W.,and Zhao,H.(2011).Cell surface display of functional human MHC class II proteins:yeast display versus insect cell display.Protein Eng.Des.Sel.24,701.)。另外，2020年，蓝勋实验室的专利申请CN112501269A中记载了利用改造的酵母交配系统研究TCR抗原的交叉反应活性，能够实现不通过蛋白纯化的方式研究TCR与抗原的相互作用，筛选出能够与特定TCR结合的抗原序列。但是这类方法并不能够实现双向筛选。
[0007]由此发现，现有技术中还缺少一种能够高效，省时省力地双向筛选相互作用的TCR和pMHC的方法。该筛选方法能够实现快速双向确定相互作用的TCR和pMHC序列，可应用于如针对特定病毒抗原的各种突变体组成的集合进行的TCR筛选，帮助筛选出针对特定抗原片段的集合中的抗原具有相互作用能力的TCR。

技术实现思路

[0008]针对上述现有技术的不足之处，本申请的专利技术人提出一种方法，该方法利用酵母展示技术与酵母交配系统，在酵母表面分别展示TCR文库和pMHC文库，进一步通过酵母交配系统研究相互作用的TCR和pMHC，实现了TCR和pMH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双向筛选相互作用的TCR和抗原
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MHC复合物(pMHC)的方法，其包括：(a)将多种TCR和多种pMHC展示到不同酵母细胞表面，其中展示TCR的酵母细胞和展示pMHC的酵母细胞属于不同的交配型；(b)共培养所述展示TCR的酵母细胞和所述展示pMHC的酵母细胞；(c)筛选出酵母细胞二倍体，并确定所述酵母细胞二倍体的TCR和pMHC；由此筛选出相互作用的TCR和pMHC；其中所述酵母细胞是交配缺陷型的；优选地，所述展示TCR的酵母细胞以整合形式表达TCR；优选地，所述展示pMHC的酵母细胞以整合形式表达pMHC。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述交配缺陷型酵母细胞是Sag1基因缺失的酵母细胞。3.根据权利要求1
‑
2所述的方法，其中所述酵母细胞是酿酒酵母，优选所述酿酒酵母为EBY100菌株或EBY100菌株的遗传改造菌株。4.根据权利要求1
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3任一项所述的方法，其中在将多种TCR展示到酵母细胞表面时，整合第一标签到所述酵母细胞中；在将多种pMHC展示到酵母细胞表面时，整合第二标签到所述酵母细胞中；其中第一标签和每种TCR之间存在对应关系，第二标签和每种pMHC之间存在对应关系。5.根据权利要求4所述的方法，其中在所述(a)之后，所述(b)之前，分别确定TCR和第一标签之间的对应关系以及pMHC和第二标签之间的对应关系。6.根据权利要求5所述的方法，其中确定所述酵母细胞二倍体的TCR和pMHC的方法是通过测得酵母细胞二倍体中的第一标签和第二标签来确定的。7.根据权利要求4
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6任一项所述的方法，其中所述第一标签或第二标签是条形码序列。8.根据权利要求7...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝勋，王莉惠，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：