一种生产角鲨烯的酿酒酵母及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种生产角鲨烯的酿酒酵母及其构建方法与应用。在本发明专利技术公开的重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，通过构建支架蛋白协同表达酵母内源异戊烯基焦磷酸(IPP)异构酶IDI1、双功能法尼基焦磷酸(FPP)合成酶ERG20和角鲨烯合成酶SQS，并通过引入以EL222

【技术实现步骤摘要】
一种生产角鲨烯的酿酒酵母及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于合成生物学和发酵工程领域，涉及一种生产角鲨烯的酿酒酵母及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]角鲨烯最早在深海鲨鱼的肝脏中被发现。近年来，人们陆续在植物及其油料中成功提取出角鲨烯。这些传统的方法，普遍存在提取工艺复杂、产品得率低、环境污染严重等问题，还对野生动植物资源造成破坏。为了满足市场对角鲨烯的大量需求，急需寻求其他绿色、高效、可持续的角鲨烯合成方法。近年来兴起的利用微生物合成角鲨烯的方法，具有生产周期短、操作简单、经济效益高且不受原材料和环境限制的优点。
[0003]目前，利用微生物合成角鲨烯，大多选择以大肠杆菌和酵母为底盘细胞。大肠杆菌可通过2
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甲基赤藓醇磷酸(MEP途径)合成角鲨烯，然而，MEP途径在供应异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)进行产物合成时效率较低，且MEP途径缺乏转录后修饰机制，难以表达细胞色素P450单加氧酶(P450s)，因而限制了角鲨烯等萜类物质的合成。相比之下，酵母不仅具有内源的甲羟戊酸途径以及固醇的合成途径，有充足的前体供应于角鲨烯的合成，而且酵母自身具有完整的细胞内膜系统，非常易于角鲨烯合成相关酶及P450酶的表达。所以，酵母作为主要的宿主被用于角鲨烯的生物合成具有广阔的应用前景。
[0004]角鲨烯在酿酒酵母中的合成路径包括以下步骤，在细胞质内葡萄糖经糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶催化作用下生成乙酰辅酶A，以乙酰辅酶A为前体，经七步酶：硫解酶、HMG
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CoA合成酶、HMG
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CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5
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磷酸甲羟戊酸激酶、5
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磷酸甲羟戊酸脱羧酶和IPP异构酶(ERG10、ERG13、HMG1、ERG12、ERG8、MVD1和IDI1)反应合成萜类化合物基本五碳单元IPP和DMAPP，随后在双功能法尼基焦磷酸(FPP)合成酶(ERG20)的作用下两分子IPP和一分子DMAPP头尾缩合生成FPP，最后在角鲨烯合成酶(SQS)的作用下生成角鲨烯。由于涉及到多步酶催化反应，存在酶催化底物分散而导致催化效率低、产品产量低的问题。除此之外，细胞内的角鲨烯在角鲨烯环氧酶(ERG1)等酶的作用下经两步催化生成麦角固醇，后者是细胞膜必不可少的组分之一，若将ERG1敲除则导致细胞无法正常生长。
[0005]随着转基因技术的发展，可控的基因表达调控系统成为生物医学研究及生物技术中不可或缺的工具。过去的几十年，化学调控的基因表达系统被广泛用于从时间上调控基因的表达。但是，由于这些小分子诱导物可以自由地扩散，难以消除以及对细胞功能潜在的脱靶效应，所以很难在空间和时间上精确地控制基因的表达。然而，光是一种理想的基因表达诱导物，可控强，没有毒性，并且可以实现对目的基因表达的时间、空间双重精确控制。EL222转录因子，最初源于一个细菌的光
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氧
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压蛋白，被蓝光照射时就会二聚化结合到C120DNA上，激活下游基因的表达。这个系统的光依赖转录激活作用只需少量元件，一个光敏结构域LOV，一个螺旋
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转角
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螺旋(H
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T
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H)DNA结合结构域。黑暗时LOV结构域结合着HTH结构域，覆盖了对于成为二聚体而结合到C120 DNA所必需的HTH4α位点。蓝光照射会触发光化学反应：LOV结构域中的黄素蛋白复合物打断了LOV和HTH的相互作用，使EL222二聚化，从而
发挥DNA结合蛋白活性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于通过对酿酒酵母进行基因改造，使其能够高效生产角鲨烯。
[0007]为实现上述目的，本专利技术利用支架蛋白技术将合成角鲨烯的三个关键酶IDI1、ERG20和SQS进行协同表达，酿酒酵母中角鲨烯的合成路径如图1所示，还引入以EL222
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VP16
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NLS核定位的光敏元件和C120 DNA结合序列为基础的光调控表达系统实现角鲨烯生产过程的分段调控，提高了重组酿酒酵母中角鲨烯的产量。
[0008]在第一个方面，本专利技术提供一种重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，通过构建支架蛋白协同表达酵母内源异戊烯基焦磷酸(IPP)异构酶IDI1、双功能法尼基焦磷酸(FPP)合成酶ERG20和角鲨烯合成酶SQS，并通过引入以EL222
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VP16
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NLS核定位的光敏元件和C120DNA结合序列为基础的光调控表达系统调控酵母内源角鲨烯环氧酶基因ERG1和GAL80的表达。
[0009]EL222
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VP16
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NLS核定位的光敏元件中，EL222是光敏转录因子，接收光信号以后结合到启动子的C120 DNA结合序列，开启下游基因的转录；基因转录需要RNA聚合酶，VP16是转录激活域，作用是招募RNA聚合酶；NLS是核定位信号肽。EL222
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VP16
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NLS的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中第1
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80位为EL222，第81
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216位为VP16，第217
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223位为NLS。
[0010]有蓝光存在时，EL222
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VP16
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NLS核定位的光敏元件能够激活C120启动子，从而使ERG1和GAL80基因表达，ERG1基因表达使细胞正常转化角鲨烯为麦角固醇，细胞生长正常；GAL80基因表达生成GAL80蛋白，此蛋白结合细胞内GAL4转录激活因子，使GAL4失活从而无法激活GAL1和GAL10启动子，IDI1、ERG20和SQS基因不表达。当撤去蓝光时，ERG1基因无法表达，细胞生长停滞，细胞内开始积累角鲨烯；GAL80基因无法表达，于是GAL4转录激活因子能够正常激活GAL1和GAL10启动子，此时IDI1、ERG20和SQS能够正常表达，促进角鲨烯的积累。总之，分段调控是以有无蓝光存在为根本区别，蓝光存在，细胞正常生长，消耗角鲨烯，增加细胞OD，角鲨烯不积累；撤去蓝光，合成角鲨烯的路径基因增强，细胞不消耗角鲨烯且停止生长，细胞内积累角鲨烯。
[0011]在一些实施方案中，上述重组酿酒酵母中，所述重组酿酒酵母以BY4742为出发菌株。
[0012]在一些实施方案中，上述任一所述的重组酿酒酵母中，所述支架蛋白为GBD
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SH3
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PDZ支架蛋白，其中的元件为来自大鼠N
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WASP的GBD，来自小鼠Crk的SH3和来自小鼠α
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syntrophin的PDZ，GBD结构域、SH3结构域和PDZ结构域通过GS接头连接，所述GS接头共有9个GS短肽重复单元；GBD
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SH3
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PDZ支本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，通过构建支架蛋白协同表达酵母内源异戊烯基焦磷酸(IPP)异构酶IDI1、双功能法尼基焦磷酸(FPP)合成酶ERG20和角鲨烯合成酶SQS，并通过引入以EL222
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VP16
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NLS核定位的光敏元件和C120 DNA结合序列为基础的光调控表达系统调控酵母内源角鲨烯环氧酶基因ERG1和GAL80的表达。2.如权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于：所述重组酿酒酵母以BY4742为出发菌株。3.如权利要求1或2所述的重组酿酒酵母，其特征在于：所述支架蛋白为GBD
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SH3
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PDZ支架蛋白，其中的元件为来自大鼠N
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WASP的GBD，来自小鼠Crk的SH3和来自小鼠α
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syntrophin的PDZ；协同表达时，IDI1与支架蛋白GBD
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SH3
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PDZ中的GBD配体连接，ERG20与支架蛋白GBD
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SH3
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PDZ中的SH3配体连接，SQS与支架蛋白GBD
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SH3
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PDZ中的PDZ配体连接。4.如权利要求1
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3任一项所述的重组酿酒酵母，其特征在于：所述C120 DNA结合序列包含在光控启动子P
C120
中，用光控启动子P
C120
替换ERG1的启动子和GAL80的启动子。5.构建权利要求1
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4任一项所述的重组酿酒酵母的方法，包括以下步骤：将出发菌株的内源角鲨烯环氧酶基因ERG1和GAL80的启动子均替换为含有C120 DNA结合序列的光控启动子，再转入表达支架蛋白和EL222
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VP16
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NLS核定位的光敏元件的质粒P1和表达内源异戊烯基焦磷酸(IPP)异构酶IDI1、双功能法尼基焦磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琛，王竞辉，单雨瑶，张雅萍，王婕，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：