一种生产视黄醛的酿酒酵母重组菌株及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种生产视黄醛的酿酒酵母重组菌株及其构建方法，该构建方法包括将酿酒酵母的adh6基因、adh7基因、sfa1基因、gre2基因和hfd1基因进行敲除，获得工程菌株，使所述工程菌株异源表达香叶基香叶基二磷酸合成酶CrtE、双功能番茄红素环化酶/茄红素合成酶CrtYB、番茄红素脱氢酶CrtI和β

【技术实现步骤摘要】
一种生产视黄醛的酿酒酵母重组菌株及其构建方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种生产视黄醛的酿酒酵母重组菌株及其构建方法。

技术介绍

[0002]视黄醛，是维生素A的醛形式，已被用于食品、化妆品、药品、保健品和动物饲料添加剂，主要是因为它们具有抗氧化、抗癌、抗感染和抗皱等功能。为了应对人们对健康补充剂日益增长的需求，视黄醛已可以通过化学合成进行商业化生产。然而，化学合成中需要添加石油基化学品，如丙酮和乙炔，用于酸化和水解。后期处理也需繁琐的纯化过程，以去除产生的副产物。因此，利用其他温和替代方法制备维生素A成为研究热点。例如，通过来源于自古细菌Halobacterium sp.NRC
‑
1的β
‑
胡萝卜素
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15,15
’‑
加双氧酶将β
‑
胡萝卜素转化为视黄醛。然而，利用纯化的酶和β
‑
胡萝卜素也增加合成成本。
[0003]近年来采取微生物法通过廉价原料发酵生产视黄醛成为趋势，具有成本低、能耗低，绿色环保等优势。微生物法通常使用葡萄糖为初始底物，利用大肠杆菌、解酯酵母或酿酒酵母等微生物作为底盘细胞，将葡萄糖通过内源性的甲基赤藓醇磷酸(MEP)或者甲羟戊酸(MVA)途径，再经由香叶基二磷酸合成酶(CrtE)、双功能番茄红素环化酶/茄红素合成酶(CrtYB)、番茄红素脱氢酶(CrtI)及β
‑
胡萝卜素
‑
15,15
’‑
加双氧酶(BCMO，由BLH基因编码)获得视黄醛。目前利用大肠杆菌合成维生素A的研究中，菌株产量为136mg
·
L
‑1，其中包含了视黄醇、视黄醛和视黄醇乙酸酯三者的混合物。另外，通过酿酒酵母工程菌从木糖中合成维生素A，其最终视黄醛和视黄醇产量比值为1.67。最近的研究中，利用解酯酵母工程菌株，通过结合BHT处理和使用吐温80提取，最终工程菌株在5升发酵罐中通过分批补料发酵，产生了4.86g
·
L
‑1的视黄醇和0.26g
·
L
‑1的视黄醛，这是迄今为止报道的最高视黄醇的生产量。
[0004]然而，上述的菌株中在生产视黄醛的时候，会伴随着视黄醇、视黄酸等副产物，或者是将已生产的视黄醛转变为视黄醇和视黄酸。使得视黄醛的产量和纯度受限。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的目的在于提供一种生产视黄醛的酿酒酵母重组菌株的构建方法。该重组菌株可提高视黄醛的纯度。
[0006]为此，在本专利技术的一方面，本专利技术提出了一种生产视黄醛的酿酒酵母重组菌株的构建方法，其包括：
[0007]将酿酒酵母的adh6基因、adh7基因、sfa1基因、gre2基因和hfd1基因进行敲除，获得工程菌株，使所述工程菌株异源表达香叶基香叶基二磷酸合成酶CrtE、双功能番茄红素环化酶/茄红素合成酶CrtYB、番茄红素脱氢酶CrtI和β
‑
胡萝卜素
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15,15
’‑
加双氧酶BCMO，获得酿酒酵母重组菌株。
[0008]根据本专利技术实施例的一种生产视黄醛的酿酒酵母重组菌株的构建方法，该方法通
过敲除酿酒酵母氧化还原酶adh6、adh7、sfa1、gre2、hfd1，获得可避免视黄醛被内源氧化还原酶转变为视黄醇和视黄酸的菌株，以质粒异源表达香叶基香叶基二磷酸合成酶CrtE、双功能番茄红素环化酶/茄红素合成酶CrtYB、番茄红素脱氢酶CrtI和β
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胡萝卜素
‑
15,15
’‑
加双氧酶BCMO，重组菌株经培养120h后，胞外视黄醛(纯度>99％)含量为4.80
±
0.20mg/L。解决了酿酒酵母无法生产高纯度视黄醛的问题，具有广阔的工业化应用前景。
[0009]另外，根据本专利技术上述实施例提出的生产视黄醛的酿酒酵母重组菌株的构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：
[0010]可选地，包括以下步骤：
[0011]将酿酒酵母BY4741内源性氧化还原酶adh6基因、adh7基因、sfa1基因、gre2基因和hfd1基因敲除，构建酿酒酵母醛积累底盘细胞JS
‑
M5；
[0012]以SEQ ID NO:29所示的序列为模板，SEQ ID NO:27所示的BLH
‑
BamHI
‑
F和SEQ ID NO:28所示的BLH
‑
XhoI
‑
R为上、下游引物，PCR扩增BLH基因，BLH基因片段与表达载体pRS425TEF2连接，得到重组质粒pRS425TEF2
‑
BLH；
[0013]将pRS425TEF2
‑
BLH质粒和YEplac195
‑
YB/I/E质粒转入酿酒酵母JS
‑
M5感受态细胞中，得到酿酒酵母重组菌株JS
‑
M5
‑
P。
[0014]进一步地，包括以下步骤：
[0015]PCR扩增获取基因编辑技术的gRNA表达片段：adh6、adh7、sfa1、gre2和hfd1，将gRNA表达片段分别与表达载体p426
‑
SNR52
‑
GGA连接，得到重组质粒p426
‑
gRNA(adh6)、重组质粒p426
‑
gRNA(adh7)、重组质粒p426
‑
gRNA(sfa1)、重组质粒p426
‑
gRNA(gre2)和重组质粒p426
‑
gRNA(hfd1)；
[0016]将所述重组质粒p426
‑
gRNA(adh6)、重组质粒p426
‑
gRNA(adh7)、重组质粒p426
‑
gRNA(sfa1)、重组质粒p426
‑
gRNA(gre2)和重组质粒p426
‑
gRNA(hfd1)与其对应的基因编辑整合片段按顺序依次转入酿酒酵母感受态细胞，得到重组菌株；
[0017]向所述重组菌株中导入重组质粒pRS425TEF2
‑
BLH质粒和YEplac195
‑
YB/I/E质粒，以便得到酿酒酵母重组菌株JS
‑
M5
‑
P。
[0018]进一步地，所述重组质粒p426
‑
gRNA(adh6)是以p426
‑
SNR52
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gRNA载体为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的F_gRNA.adh6和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的R_SUP4为引物，经PCR扩增得到gRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产视黄醛的酿酒酵母重组菌株的构建方法，其特征在于，包括：将酿酒酵母的adh6基因、adh7基因、sfa1基因、gre2基因和hfd1基因进行敲除，获得工程菌株，使所述工程菌株异源表达香叶基香叶基二磷酸合成酶CrtE、双功能番茄红素环化酶/茄红素合成酶CrtYB、番茄红素脱氢酶CrtI和β
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胡萝卜素
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15,15
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加双氧酶BCMO，获得酿酒酵母重组菌株。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将酿酒酵母BY4741内源性氧化还原酶adh6基因、adh7基因、sfa1基因、gre2基因和hfd1基因敲除，构建酿酒酵母醛积累底盘细胞JS
‑
M5；以SEQ ID NO:29所示的序列为模板，SEQ ID NO:27所示的BLH
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BamHI
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F和SEQ ID NO:28所示的BLH
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XhoI
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R为上、下游引物，PCR扩增BLH基因，BLH基因片段与表达载体pRS425TEF2连接，得到重组质粒pRS425TEF2
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BLH；将pRS425TEF2
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BLH质粒和YEplac195
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YB/I/E质粒转入酿酒酵母JS
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M5感受态细胞中，得到酿酒酵母重组菌株JS
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M5
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P。3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：PCR扩增获取基因编辑技术的gRNA表达片段：adh6、adh7、sfa1、gre2和hfd1，将gRNA表达片段分别与表达载体p426
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SNR52
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GGA连接，得到重组质粒p426
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gRNA(adh6)、重组质粒p426
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gRNA(adh7)、重组质粒p426
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gRNA(sfa1)、重组质粒p426
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gRNA(gre2)和重组质粒p426
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gRNA(hfd1)；将所述重组质粒p426
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gRNA(adh6)、重组质粒p426
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gRNA(adh7)、重组质粒p426
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gRNA(sfa1)、重组质粒p426
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gRNA(gre2)和重组质粒p426
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gRNA(hfd1)与其对应的基因编辑整合片段按顺序依次转入酿酒酵母感受态细胞，得到重组菌株；向所述重组菌株中导入重组质粒pRS425TEF2
‑
BLH质粒和YEplac195
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YB/I/E质粒，以便得到酿酒酵母重组菌株JS
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M5
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P。4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒p426
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gRNA(adh...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁吉锋，莫棋文，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：