一种丝状真菌重组菌株在纤维素酶生产领域的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种丝状真菌重组菌株在纤维素酶生产领域的应用。本发明专利技术基于对来源于里氏木霉(Trichoderma reesei，CCTCC NO:M2015804)的胞内β

【技术实现步骤摘要】
一种丝状真菌重组菌株在纤维素酶生产领域的应用


[0001]本专利技术属于纤维素酶工程菌株
，具体涉及一种里氏木霉的重组菌株、所述重组菌株在纤维素酶生产领域的应用，以及通过基因工程手段获得该重组菌株的试剂盒、方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]丝状真菌是自然界中降解木质纤维素类生物质的主要微生物，其所产的纤维素酶主要包括三种组分(纤维素内切酶、纤维素外切酶和β
‑
葡萄糖苷酶)，这三种酶相互协同对纤维素底物进行有效降解。β
‑
葡萄糖苷酶能够将来源于纤维素内切酶以及外切酶降解得到的成分
‑
低聚糖以及二糖等进一步降解为可发酵性单糖。因此，β
‑
葡萄糖苷酶在生物质的降解中发挥着非常重要的作用。
[0004]里氏木霉(Trichoderma reesei)是公认的纤维素酶高产菌株，也是纤维素酶生产工业菌株的主要来源。纤维素酶的生产需要诱导物的存在，常见的并且效果比较好的诱导物包括纤维二糖或者槐糖等，但是其比较昂贵，在纤维素酶发酵过程中容易被降解为葡萄糖，引起CCR效应；纤维素是纤维素酶发酵生产中较为常见的诱导性碳源，但是由于其不溶性，会加剧纤维素酶深层发酵中的粘度，影响发酵中的溶氧以及增加能耗，并且诱导效果比较好的微晶纤维素价格也相对比较高。因此，现在比较好的策略是用价格比较低廉的碳源替代一定量的固体诱导物是比较好的方法。葡萄糖是微生物常用的速效且廉价的碳源，但是又易引起CCR效应，从而抑制纤维素酶的生产。
[0005]碳代谢阻遏(Carbon Catabolite Repression,CCR)效应是微生物中普遍存在的一种重要调控机制，当有葡萄糖等速效碳源存在的情况下，降解复杂碳源的酶基因表达会受到明显抑制。例如，在T.reesei纤维素酶基因表达系统中，有较高浓度葡萄糖存在情况下，槐糖等诱导物无法诱导纤维素酶基因表达，同时向已表达纤维素酶的诱导培养条件下添加葡萄糖，主要的纤维素酶基因转录也会消失。因此，通过人工诱变、基因工程改造等方法改良菌株性状，选育去CCR效应的菌株，对纤维素酶工业化生产有重要意义。
[0006]胞内β
‑
葡萄糖苷酶，具有一定的水解二糖活性(参考Biotechnol Lett,2017，39(11),1717
‑
1723；Appl Environ Microbiol,2002，68(9),4546
‑
4553；Biotechnology for Biofuels,2018，11,314.)，它能够将通过转运蛋白CRT1或者MFS(参考Biotechnology for Biofuels,2020，13,158.)转运到体内的二糖诱导物降解为葡萄糖，一方面增加胞内的葡萄糖会加剧菌株的CCR效应，另一方面，胞内的诱导物被降解，从而导致纤维素酶诱导产量下降。研究发现，在单纯诱导物
‑
乳糖或者纤维素作为碳源的条件下，胞内的β
‑
葡萄糖苷酶的敲除导致在乳糖培养条件下纤维素酶的诱导延迟(参考Eukaryot Cell,2014，13(8),1001
‑
1013.)。由此可见，里氏木霉胞内β
‑
葡萄糖苷酶对于纤维素酶的诱导是一个非常复杂的过
程。并且对于额外添加葡萄糖廉价碳源从而生产纤维素酶鲜见报道。因此，专利技术人认为，通过进行敲除达到纤维素酶在葡萄糖培养条件下的高表达的方法具有很大的盲目性，并且不一定可行。

技术实现思路

[0007]基于上述技术背景，本专利技术针对丝状真菌碳阻遏效应进行了进一步研究，为了优化纤维素酶的表达，本专利技术证实了，通过对CEL1B蛋白进行了突变，纤维素酶酶活和表达量都出现了显著的提升，和出发菌株相比，纤维素酶活性(FPase activity)及菌株pNPC活性分别提高了3.83和10.6倍。
[0008]基于上述技术效果，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术第一方面，提供一种丝状真菌的重组菌株，所述重组菌株与出发菌株相比，具有CEL1B蛋白突变体，所述突变体的氨基酸序列如下：
[0010](1)如SEQ ID NO:3所示；
[0011](2)SEQ ID NO:3所述氨基酸序列具有一个或多个氨基酸添加、取代或缺失之后，仍具有相似生理活性的氨基酸序列。
[0012]第一方面所述的技术方案中，所述“一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失”是指SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失后仍然能够仍然表现出纤维素酶高表达的氨基酸序列。所述“一个或多个氨基酸”添加、改变或缺失获得的衍生序列，与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的相似性可能达到85％、90％或95％以上，所述相似性通过Blast方式确定。
[0013]上述技术方案中SEQ ID NO:3所示氨基酸序列即为cel1b
I177S/I174S
突变体，具体表示CEL1B蛋白、即SEQ ID NO:2所述氨基酸序列(NCBI Accession ID:XP_006964838.1)外显子第177和1741位的异亮氨酸I突变为丝氨酸S。
[0014]第一方面所述丝状真菌优选为工业酶，包括但不限于黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、里氏木霉(Trichoderma reesei)中的一种；本专利技术验证的一种可行的方式中，所述丝状真菌为里氏木霉(Trichoderma reesei)。
[0015]应当明确的是，只要出发菌株当中含有纤维素酶表达的代谢流及具有表达CEL1B蛋白的能力即可作为出发菌株，上述里氏木霉包括野生型里氏木霉或里氏木霉的突变株；所述突变株包括经物理、化学诱变或基因工程手段改造后的菌株。
[0016]专利技术人针对丝状真菌碳阻遏效应进行了进一步研究，将T.reesei中的胞内β
‑
葡萄糖苷酶cel1b，进行了敲除，发现葡萄糖存在条件下，主要纤维素酶基因的转录水平敲除cel1b发生下降。但是，在cel1b基因缺失的里氏木霉中，通过对CEL1B蛋白进行了突变之后，在含有葡萄糖的培养基中生长良好，且纤维素酶的产量得到提高。另外，本专利技术还提供的一种可行的方式中，所述出发菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)T1，已经于2015年12月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏编号CCTCCNO:M2015804，该菌株于专利CN105779301B中公开。
[0017]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种丝状真菌的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株与出发菌株相比，具有CEL1B蛋白突变体，所述突变体的氨基酸序列如下：(1)如SEQ ID NO:3所示；(2)SEQ ID NO:3所述氨基酸序列具有一个或多个氨基酸添加、取代或缺失之后，仍具有相似生理活性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述丝状真菌的重组菌株，其特征在于，所述丝状真菌优选为工业酶，包括但不限于黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、里氏木霉(Trichoderma reesei)中的一种；进一步的，所述丝状真菌为里氏木霉(Trichoderma reesei)。3.如权利要求3所述丝状真菌的重组菌株，其特征在于，所述里氏木霉包括野生型里氏木霉或里氏木霉的突变株；所述突变株包括经物理、化学诱变或基因工程手段改造后的菌株；优选的，所述出发菌株为通过基因工程手段敲除cel1a基因的里氏木霉；优选的，所述出发菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)T1。4.权利要求1
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3任一项所述重组菌株在纤维素酶生产或发酵领域的应用。5.一种纤维素酶的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括采用权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：方诩，韩丽娟，牛康乐，吴志红，谭银霜，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：