本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体提供了一株高产木聚糖酶的里氏木霉及其应用。申请人首先将来源于斜卧青霉（Penicillium decumbens）的木聚糖酶基因在里氏木霉宿主中过表达，构建得到重组表达菌株；然后以该菌株为出发菌进行紫外诱变，筛选获得一株能大幅度提高木聚糖酶表达量的突变菌，保藏编号为CCTCC NO：M2021920。所述突变菌株可以广泛应用于木聚糖酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。本。
【技术实现步骤摘要】
一种高产木聚糖酶的里氏木霉菌株及其应用
[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种高产木聚糖酶的里氏木霉菌株及其应用。
技术背景
[0002]木聚糖（Xylan）是植物半纤维素的主要成分，约占植物干重的三分之一。是除纤维素之外自然界中最为丰富的多糖，也是自然界中最为丰富的可再生资源之一。β
‑
１,４
‑
糖苷键连接β
‑
Ｄ
‑
吡喃木糖残基构成了木聚糖的主链，其侧链取代基多种多样。自然界中的木聚糖存在于植物细胞壁中，结构复杂，且大部分为异质多糖。木聚糖的降解主要依赖于木聚糖酶酶解，由木聚糖的复杂性和多样性可知木聚糖酶是一系列降解木聚糖的酶的组合，而不是单一的酶。目前研究最多的木聚糖酶来自微生物中的真菌和细菌，真菌只能生产碱性木聚糖酶，细菌则既能生产碱性木聚糖酶又能生产酸性木聚糖酶。木聚糖酶随机切开木聚糖的主链，得到低聚木糖、木糖和阿拉伯糖降解产物。
[0003]木聚糖酶在食品、饲料以及造纸领域都有着广泛的应用。木聚糖酶作为饲料添加剂应用在动物饲料中能够对粗纤维进行降解，从而促进动物对饲料中营养物质的吸收；木聚糖酶在纸浆漂白过程中协同其他酶能够减少化学试剂的添加，改善漂白品质和造纸工业对环境的破坏；木聚糖酶对秸秆、玉米芯等农业废弃物进行降解生成可溶性戊糖来生产低聚木糖、乙醇等产品实现生物质资源再生；木聚糖酶可作为面粉面团、面包烘焙以及馒头改良剂应用在面制品中。
[0004]另外，木聚糖酶的水解产物——低聚木糖是一种功能性低聚糖，是利用内切木聚糖酶水解木聚糖的β
‑
１,４糖苷键而得到的以木二糖、木三糖、木四糖、木五糖为主要成分的混合物。它在促进双歧杆菌等肠道益生菌增殖、降低血清胆固醇、调节血糖、促进肠道中钙的吸收和改善便秘等方面都有明显著效果。利用木聚糖酶进行酶法生产低聚木糖的过程反应比较温和，且酶具有专一性，产物中低聚木糖的纯度较高，是目前生产低聚木糖的最常用的方法。孙军涛等人的研究结果表明，在超声温度为60 ℃，超声功率为300 W，木聚糖酶与纤维素酶按照3:2的比例组成复合酶，复合酶的添加量为1 %，酶解时间为20 min，料液比为1:15（g/mL）的条件下，制备的酶解液中可溶性总糖的含量为75.01 mg/g，还原糖含量为43.61 mg/g，产物的平均聚合度为1.72。唐艳斌等报道，大豆秸秆碱性预处理液中加入嗜热踝节菌木聚糖酶，在实验条件为底物浓度1.0 %，酶添加量30 Ｕ/mL，温度60℃，时间240 min时低聚木糖得率能达到24.2%。刘国峰等研究结果显示，中性细菌木聚糖酶具有显著提高啤酒产品中功能性低聚糖的作用，并且在酶解温度为50℃，木聚糖酶添加量为110 U/g时，低聚木糖的得率最高，为0.621 g/L。
[0005]目前木聚糖酶的生产成本普遍偏高，严重限制了木聚糖酶在低聚木糖生产中的广泛应用，因此如何提高木聚糖酶的产量是当前本领域的一个研究重点。
技术实现思路
[0006]本专利技术为解决现有技术问题，提供了一株高产木聚糖酶的里氏木霉及其应用。申请人首先将来源于斜卧青霉（Penicillium decumbens）的木聚糖酶基因在里氏木霉宿主中过表达，构建得到重组表达菌株；然后以该菌株为出发菌进行紫外诱变，筛选获得一株能大幅度提高木聚糖酶表达量的突变菌。该突变菌株可以广泛应用于木聚糖酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。
[0007]本专利技术一方面提供了一种里氏木霉工程菌，其携带有重组表达木聚糖酶基因的表达载体。
[0008]所述木聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
[0009]本专利技术一方面提供了一种里氏木霉突变菌株，是以上述里氏木霉工程菌为出发菌，通过紫外诱变方法获得的。
[0010]所述突变菌株命名为里氏木霉MQ20（Trichoderma reesei MQ20），已于2021年7月21日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2021920。
[0011]本专利技术还提供了上述里氏木霉突变菌株在木聚糖酶生产中的应用。
[0012]本专利技术将来源于斜卧青霉（Penicillium decumbens）的木聚糖酶基因在里氏木霉（Trichoderma reesei）宿主中过表达，构建得到的重组表达菌株里氏木霉MQ1，30L罐发酵160h后，木聚糖酶酶活达到7610u/ml。
[0013]以里氏木霉MQ1为出发菌，通过紫外诱变方法筛选获得的突变菌株里氏木霉MQ20，30L罐发酵160h后，木聚糖酶酶活高达到16429u/ml，比出发菌里氏木霉MQ1提高了116%，取得了意料不到的技术效果。所述里氏木霉突变菌株可广泛应用于木聚糖酶的生产，从而有利于降低木聚糖酶的生产成本，促进其广泛应用于低聚木糖生产领域。
附图说明
[0014]图1为质粒pTG图谱；图2为30L罐发酵曲线图。
具体实施方式
[0015]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。
[0016]下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细描述。
[0017]实施例1 木聚糖酶基因的克隆及重组载体的构建申请人将来源于斜卧青霉（Penicillium decumbens）的木聚糖酶基因根据里氏木霉密码子偏好性进行密码子优化，在第1个氨基酸密码子前增加6个碱基TCTAGA(Xba I酶切位点)，在其终止密码子TAA后增加TCTAGA(Xba I酶切位点)，优化后的核苷酸序列由上海捷
瑞生物工程公司合成。所述木聚糖酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1，其编码核苷酸序列为SEQIDNO:2。
[0018]PCR扩增上述木聚糖酶基因。引物序列如下：引物1（F）：GCTCTAGAATGGTTCATCTGTCTGCCACC；引物2（R）：GCTCTAGATTACAAGCACTGAGAGTACCA。
[0019]PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸70s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，木聚糖酶基因为大小1233bp的片段。
[0020]将上述获得的木聚糖酶基因片段与表达载体pTG分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：PCR片段酶切体系（50ul）质粒pTG酶切体系（50ul）PCR片段 20ulp本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种里氏木霉工程菌，其特征在于，所述的里氏木霉工程菌携带有重组表达木聚糖酶基因的表达载体。2.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌，其特征在于，所述木聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。3.一种里氏木霉突变菌，其特征在于，所述的里氏木霉突变菌是以权利要求2所述的里氏木霉工程菌为出发菌，通过紫外诱变获...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓东，李瑞，许丽红，宋清清，陆娜，
申请(专利权)人：权利要求书一页说明书六页序列表三页附图一页，
类型：发明
国别省市：
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