一种利用出芽短梗霉生产中分子量普鲁兰多糖的方法技术

本发明专利技术对保藏编号为CGMCC NO.23807的出芽短梗霉敲除或弱化代谢通路中的聚苹果酸合成酶基因得到的重组菌，并用于发酵生产中分子量的普鲁兰多糖的方法。本发明专利技术通过敲除代谢通路中的聚苹果酸合成酶基因，成功将该菌株生产的普鲁兰多糖重均分子量Mw从3.3

【技术实现步骤摘要】
一种利用出芽短梗霉生产中分子量普鲁兰多糖的方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及利用出芽短梗霉生产中分子量普鲁兰多糖的方法。

技术介绍

[0002]普鲁兰多糖（Pullulan）是由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）利用糖质化合物好氧发酵生产的胞外多糖，由α
‑
1,4
‑
糖苷键连接而成的麦芽三糖重复单位通过α
‑
1,6
‑
糖苷键连接而成的直链多糖，其分子量为几千到上百万道尔顿。普鲁兰多糖成品是近白色、无味的粉末，是一种耐酸、耐碱、耐高温的高分子聚合物。普鲁兰多糖极易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂,在冷水或者热水都可以快速溶解，溶解速率比羟甲基纤维素、羧基纤维素、淀粉等快数倍；普鲁兰多糖具有可食、透明、耐油、阻氧、弹性强等特点，可直接制备成膜或者喷、涂在物体表面成膜，该膜具有阻氧好、透湿性强、强度大等特点，可以起到保鲜、阻氧的作用，被认为是制备食品包装可食用薄膜的理想材料之一。普鲁兰多糖的天然来源及其作为成膜材料的优越性能已使其成为胶囊制备的优良材料。利用普鲁兰多糖制备的胶囊抗冲击能力强，质量稳定，不易脆碎，崩解稳定，不易水解,氧透过率是羟丙基甲基纤维素胶囊的1/300，明胶胶囊的1/8，可很好的保护内容物免于氧化，在高品质胶囊的制备方面，普鲁兰多糖极具优势。
[0003]不同分子量的普鲁兰多糖应用领域不同：用于胶囊制备的普鲁兰多糖分子量要求大于3
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105Da，用于食品保鲜成膜的普鲁兰多糖分子量大于2
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105Da，而用作化妆品添加剂和低热值食品添加剂的普鲁兰多糖分子量则越低越好。CN107760608A公开了一种高效生产低分子量普鲁兰多糖的菌株，其分子量小于2
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105Da；CN108721632A公开了一种普鲁兰多糖添加剂在胶囊制备中的应用，其分子量≥1.8
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105Da；哈佛大学研究人员2022年发表的文章：利用普鲁兰多糖纤维涂层延长牛油果货架期和减少其重量损失；比利时胶囊公司在专利CN110678555A中记载出芽短梗霉ATCCNo.42023，发酵100h可产2
‑5×
105Da分子量的普鲁兰多糖，并将其应用于胶囊制作中。
[0004]因此中分子量的普鲁兰多糖在胶囊应用和食品保鲜领域更具有应用前景，提高普鲁兰多糖的产量和性能，降低普鲁兰多糖的生产成本是促进其产业化应用的关键因素。通过代谢途径改造菌株，是提高多糖产量和控制其分子量的重要策略。然而目前尚未完全解析普鲁兰多糖的合成途径，缺乏分子量的精确控制机制。研究多集中于针对产黑色素的相关基因的敲除，以及敲除普鲁兰多糖降解相关基因提高分子量。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于获得产生分子量降低而产量提高的普鲁兰多糖的出芽短梗霉。
[0006]本专利技术提供一种提高普鲁兰多糖产量的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans），其是对保藏编号为CGMCC NO.23807的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）敲除或弱化代谢通路中的聚苹果酸合成酶基因得到的重组菌。
[0007]优选地，完全敲除聚苹果酸合成酶基因。
[0008]本专利技术提供所述的出芽短梗霉的制备方法，通过基因工程方法将保藏编号为CGMCC NO.23807的出芽短梗霉的代谢通路中的聚苹果酸合成酶基因进行敲除或弱化，得到提高普鲁兰多糖产量的重组菌。
[0009]具体地，所述敲除或弱化是指通过部分或全部敲除所述聚苹果酸合成酶基因的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子及调控区或翻译调控区等改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构稳定性减弱、通过sRNA对基因进行弱化调控、通过外源性添加抑制剂减弱或者抑制酶活性。
[0010]更优选地，所述基因工程方法是基因编辑的方法。
[0011]本专利技术由此提供所述的出芽短梗霉在制备普鲁兰多糖中的应用。
[0012]本专利技术也提供利用所述的出芽短梗霉制备普鲁兰多糖的方法，将所述出芽短梗霉发酵获得含有高浓度普鲁兰多糖的发酵液。
[0013]具体实施方式中，所述发酵的温度28
±
2℃，搅拌转速400
‑
600rpm/min后在溶氧降至20%时升高至700
‑
900rpm/min，通气量2
‑
4vvm；发酵30
‑
42h后向发酵液中以80
‑
120mL/h的速率添加蔗糖溶液，发酵100
‑
120h，即得含有高浓度普鲁兰多糖的发酵液。
[0014]优选实施方式中，所述添加的蔗糖溶液浓度为100
‑
140g/L。
[0015]更具体地，所述发酵采用的培养基的组成，按质量百分含量为：蔗糖11.6%，酵母浸粉0.28%，硫酸铵0.07%，磷酸氢二钾0.45%，七水硫酸镁0.02%，氯化钠0.09%，单蒸水溶解并定容；调pH为6.5~7.5，121℃灭菌15min。
[0016]本专利技术还提供一种普鲁兰多糖在胶囊或食品保鲜中的应用，所述普鲁兰多糖由采用所述的方法获得的。其中，普鲁兰多糖作为食品保鲜剂，可直接喷涂于食品表面或作为食品包装膜材料，利用静电纺丝技术制备的纤维包装材料，具有保水阻隔空气、抑制食品（尤其是果蔬）表面细菌滋生、安全低毒、生物可降解等优势。普鲁兰多糖的成膜优越性和极佳的阻氧性能使其在胶囊壳应用中具有广阔的市场。本专利技术中的普鲁兰多糖因其产量和分子量等优势，使其在各种胶囊类型如硬胶囊、软胶囊制备中均具有良好的应用前景。由于本专利技术获得的分子量降低而产量提高的普鲁兰多糖在所述应用具有更明显的优势。
[0017]专利技术有益效果在于，本专利技术通过对保藏编号为CGMCC NO.23807的出芽短梗霉中的聚苹果酸合成酶基因（PMAs）进行敲除，其产生的普鲁兰多糖的分子量降低至6
×
105‑8×
105Da，产量提高50%。而不同分子量范围的普鲁兰多糖具有不同的粘稠度，因此获得中分子量、低粘稠度的普鲁兰多糖生产菌株，对于提高普鲁兰多糖的产量，降低普鲁兰多糖的生产成本具有重要的意义。同时，中分子量的普鲁兰多糖在胶囊制备和食品保鲜领域更具潜力。因此，本专利技术具有较大的实用价值。
附图说明
[0018]图1为出芽短梗霉BL80的菌落形态。
[0019]图2为出芽短梗霉BL80ΔPMAs在5L发酵罐中补料发酵产普鲁兰多糖曲线图。
[0020]生物材料保藏信息：本专利技术的出芽短梗霉菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究
所，邮编100101。保藏日期为2021年11月11日，保藏号为CGMCCNo.23807；该菌株的分类命名：出芽短梗霉本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高普鲁兰多糖产量的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans），其特征在于，对保藏编号为CGMCC NO.23807的出芽短梗霉敲除或弱化代谢通路中的聚苹果酸合成酶基因得到的重组菌。2.如权利要求1所述的出芽短梗霉，其特征在于，完全敲除聚苹果酸合成酶基因。3.如权利要求1或2所述的出芽短梗霉的制备方法，其特征在于，通过基因工程方法将保藏编号为CGMCC NO.23807的出芽短梗霉的代谢通路中的聚苹果酸合成酶基因进行敲除或弱化，得到提高普鲁兰多糖产量的重组菌。4.如权利要求1或2所述的出芽短梗霉的制备方法，其特征在于，所述敲除或弱化是指通过部分或全部敲除所述聚苹果酸合成酶基因的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子及调控区或翻译调控区的改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构稳定性减弱、通过sRNA对基因进行弱化调控、通过外源性添加抑制剂减弱或者抑制酶活性。5.如权利要求3所述的出芽短梗霉的制备方法，其特征在于，所述基因工程方法是基因编辑的方法。6.如权利要求1或2所述的出芽短梗霉在制备普鲁兰多糖中的应用。7.利用如权利要求1或2所述的出芽短梗霉制备普鲁兰多糖的方法，其特征在于将所述出芽短...

【专利技术属性】
技术研发人员：柏文琴，马延和，宋诙，陈淑宇，高佳琪，付晓平，陈利梅，谭明，郑宏臣，徐健勇，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：