一种生产L-苹果酸的里氏木霉工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种生产L

An engineering strain of Trichoderma reesei producing L-malic acid and its application

【技术实现步骤摘要】
一种生产L
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苹果酸的里氏木霉工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，特别是涉及一种生产L
‑
苹果酸的里氏木霉工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]L
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苹果酸作为一种重要的四碳二元羧酸，主要用于食品、医药等行业。在食品行业，由于其酸味持久柔和、解渴爽口、风味别致、性质稳定，主要用作食品、饮料中的酸味剂，是目前世界食品行业中公认的安全、无毒无害的食用有机酸。在医药行业，L
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苹果酸被用于治疗肝病、尿毒症、贫血等多种疾病。此外，L
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苹果酸常被配入复合氨基酸注射液中促进氨基酸的吸收。因此，国际市场上对L
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苹果酸的需求量与日俱增。美国能源部将苹果酸作为可通过微生物发酵生产的12种平台化合物之一。
[0003]传统化学方法合成的产品为外消旋的D/L
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苹果酸混合物，限制了其在食品和医药行业的应用；以微生物发酵生产纯的L
‑
苹果酸具有较好经济和社会效益，受到研究者的广泛关注和高度重视。
[0004]里氏木霉的优势：里氏木霉作为重要的工业生产菌株，是GRAS(Generally Regarded as Safe)菌株，已被广泛应用于食品、饲料等发酵行业。然而由于里氏木霉菌株不能生产L
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苹果酸，因此，本专利技术通过代谢工程改造，构建里氏木霉工程菌株用于L
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苹果酸的发酵生产。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种生产L
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苹果酸的里氏木霉工程菌及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该工程菌可以生产大量的L
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苹果酸，为微生物来源的L
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苹果酸提供了新的方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种里氏木霉工程菌，以丝状真菌里氏木霉菌或者里氏木霉菌来源的衍生菌为出发菌株经过基因改造导入外源基因，使不具备生产L
‑
苹果酸的所述出发菌株能够生产L
‑
苹果酸。
[0008]优选的是，所述里氏木霉工程菌导入正调控四碳二元羧酸转运蛋白和/或丙酮酸羧化酶表达的基因，使所述里氏木霉工程菌具备生产L
‑
苹果酸的功能。
[0009]优选的是，所述里氏木霉包括里氏木霉菌株QM6a(购买于美国模式培养物集存库ATCC 13631)，QM9414(购买于美国模式培养物集存库ATCC 26921)，Rut
‑
C30(购买于美国模式培养物集存库ATCC 56765)，RL
‑
P37(美国农业研究菌种保藏中心NRRL15709)，NG14(购买于美国模式培养物集存库ATCC 56767)，PC
‑3‑
7(购买于美国模式培养物集存库ATCC 66589)。
[0010]本专利技术还提供一种所述的里氏木霉工程菌的构建方法，包括以下步骤：
[0011]将包含四碳二元羧酸转运蛋白和/或丙酮酸羧化酶编码基因的载体转入里氏木霉
菌或者里氏木霉菌来源的衍生菌中，获得表达四碳二元羧酸转运蛋白和/或丙酮酸羧化酶的菌株，即为所述里氏木霉工程菌。
[0012]优选的是，所述四碳二元羧酸转运蛋白源自于米曲霉或裂殖酵母注释的具有表达四碳二元羧酸转运功能的蛋白编码基因。
[0013]优选的是，所述丙酮酸羧化酶源自于米曲霉注释的具有表达丙酮酸羧化酶功能的蛋白编码基因。
[0014]本专利技术还提供一种生产L
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苹果酸的方法，利用所述的里氏木霉工程菌孢子接种于液体培养基，在28℃条件下震荡培养，获取L
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苹果酸。优选的是，接种量按照108个孢子/50mL的接种量接种液体培养基。
[0015]优选的是，所用培养基包括以下浓度组分：碳源40
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100g/L，蛋白胨1
‑
6g/L，KH2PO40.15g/L，K2HPO
4 0.15g/L，CaCl2·
2H2O 0.10g/L，MgSO4·
7H2O 0.10g/L，碳酸钙80g/L，NaCl 0.05g/L，1mL/L微量元素液；所述微量元素包括以下浓度的组分：1.6gMnSO4·
4H2O，5g FeSO4·
7H2O，2g CoCl2·
6H2O，1.4g ZnSO4·
7H2O，用水溶解并定容至1L。
[0016]优选的是，所述碳源包括甘油、葡萄糖、木糖、液化淀粉、微晶纤维素或者葡萄糖/β
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二糖混合物任一种。
[0017]本专利技术还提供一种所述的里氏木霉工程菌，或者所述的方法在生产L
‑
苹果酸方面的应用。
[0018]本专利技术公开了以下技术效果：
[0019]本专利技术以里氏木霉菌为出发菌株，经过基因改造，使改造后的菌株能够表达四碳二元羧酸转运蛋白和丙酮酸羧化酶，使原先不具备L
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苹果酸生产能力的里氏木霉，改造为可以高效合成分泌L
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苹果酸的工程菌株。本专利技术获得的工程菌株能以葡萄糖、甘油、木糖、液化淀粉、微晶纤维素或葡萄糖/β
‑
二糖混合物等常见碳源，直接发酵生产大量L
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苹果酸，其最高产量可达100g/L。本专利技术为微生物来源的L
‑
苹果酸的生产提供了新的方法，可应用于L
‑
苹果酸的工业化生产。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1为本专利技术中表达质粒构建流程图；A：Aomae1表达载体；B：Spmae1表达载体；C：Aopyc表达载体；
[0022]图2为本专利技术中以葡萄糖为碳源时，基因工程菌株的L
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苹果酸产量；
[0023]图3为本专利技术中以甘油、木糖、液化淀粉、微晶纤维素、葡萄糖/β
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二糖混合物为碳源时，基因工程菌株TrMM004的L
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苹果酸产量。
具体实施方式
[0024]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0025]实施例1基因工程菌的L
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苹果酸发酵
[0026]将基因工程菌接种至250mL三角瓶中的50mL以甘油、葡萄糖、木糖、液化淀粉(Huang et al.Direct production of itaconic acid from liquefied corn本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种里氏木霉工程菌，其特征在于，以丝状真菌里氏木霉菌或者里氏木霉菌来源的衍生菌为出发菌株经过基因改造导入外源基因，使不具备生产L
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苹果酸的所述出发菌株能够生产L
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苹果酸。2.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌，其特征在于，所述里氏木霉工程菌导入四碳二元羧酸转运蛋白和/或丙酮酸羧化酶表达的基因，使所述里氏木霉工程菌具备生产L
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苹果酸的功能。3.如权利要求2所述的里氏木霉工程菌，其特征在于，所述里氏木霉包括里氏木霉菌株QM6a，QM9414，Rut
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C30，RL
‑
P37，NG14以及PC
‑3‑
7。4.一种如权利要求1
‑
3任一项所述的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将包含四碳二元羧酸转运蛋白和/或丙酮酸羧化酶编码基因的载体转入里氏木霉菌或者里氏木霉菌来源的衍生菌中，获得表达四碳二元羧酸转运蛋白和/或丙酮酸羧化酶的菌株，即为所述里氏木霉工程菌。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述四碳二元羧酸转运蛋白源自于米曲霉或裂殖酵母注释的具有表达四碳二元羧酸转运功能的蛋白编码基因。6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶源自于米曲霉注释的具有表达丙酮酸羧化酶功能的蛋白编码基因。7...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玮，陈雨蒙，
申请(专利权)人：王玮，
类型：发明
国别省市：