一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体提供了一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株，所述菌株为带有用于重组表达纤维膨胀蛋白基因Clocl

【技术实现步骤摘要】
一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株、构建方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]木质纤维素是一类分布广泛、数量庞大、处理困难的可再生资源，将其转化成可再生能源具有重要意义。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，纤维素是一种高度有序、结合紧密的晶体结构，它与半纤维素紧密相连，外周由木质素包围，要将纤维素直接水解成可利用的葡萄糖相当困难。目前，木质纤维素的酶水解大多使用来源于丝状真菌的纤维素酶，比较典型的有木霉属、曲霉属和青霉属等，但酶解过程中耗酶量高、活性极易受到产物的抑制，且这些酶蛋白不耐高温，不耐酸碱，制约了其大规模应用。
[0003]嗜热纤维梭菌是目前自然界中已知的降解纤维素最高效的微生物之一，分泌的纤维小体具有极强的纤维素降解能力。纤维小体降解纤维素的能力大约是木霉属的50倍，这种高效性取决于纤维小体的特殊结构。热纤梭菌本身是一种严格厌氧的嗜热微生物，特殊的生长条件，使得分泌的木质纤维素水解酶具有较好的耐热性、杂菌污染的风险极小。
[0004]纤维膨胀蛋白是一类没有糖苷键水解活性的蛋白，它可以促使植物细胞壁中的纤维素中的纤维发生滑动从而改变纤维素的结晶结构，做到破坏纤维素结构而不产生还原糖。由于纤维膨胀蛋白可以使天然纤维材料的纤维结构变得膨胀疏松，因此可以与纤维素酶协同作用以提高木质纤维素的水解效率。但是作为有活性的重组蛋白，完整的纤维膨胀蛋白的异源表达还比较少。

技术实现思路
/>[0005]为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌、构建方法及应用，通过纤维膨胀蛋白的协同作用增强了热纤梭菌的酶水解效率，在相同酶解条件下，相比传统的纤维素酶水解，水解效率更高。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术一方面提供了一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株，所述菌株为重组表达纤维膨胀蛋白基因Clocl
‑
1298得到的热纤梭菌工程菌。
[0007]所述菌株为将热纤梭菌cel9K基因中SEQ ID No:1的核苷酸序列替换为纤维膨胀蛋白基因Clocl
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1298的核苷酸序列重组得到的工程菌。
[0008]所述纤维膨胀蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。得到的所述热纤梭菌工程菌包括如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。
[0009]所述纤维膨胀蛋白基因Clocl
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1298来源于克莱弗雷梭菌Clostridium clarifavum DSM19732。
[0010]本专利技术另一方面提供了一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株的构建方法，将纤维膨胀蛋白基因Clocl
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1298重组表达到热纤梭菌基因组上，得到可以分泌纤维膨胀蛋白的
工程菌株。
[0011]优选的，以热纤梭菌为出发菌株，将热纤梭菌基因组上cel9K基因的部分序列（如SEQ ID No:1所示）替换为纤维膨胀蛋白基因Clocl
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1298的基因序列，得到重组热纤梭菌工程菌株，替换后的纤维膨胀蛋白基因Clocl
‑
1298具有如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。
[0012]所述热纤梭菌为热纤梭菌（Clostridium thermocellum）PN2102，保藏日期为 2021年07月09日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC No.22869。
[0013]本专利技术的可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株的构建方法，具体步骤为：（1）设计及构建纤维膨胀蛋白基因插入的重组质粒PUC
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Clocl
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1298；（2）将纤维膨胀蛋白基因与线性化的模板质粒组成的重组质粒PUC
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Clocl
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1298转入热纤梭菌；（3）挑选及PCR验证阳性单克隆并培养，获得阳性转化菌株。
[0014]本专利技术还提供了上述可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株在木质纤维素水解中的应用，通过将热纤梭菌工程菌的厌氧发酵发酵液复配纤维素酶对秸秆纤维进行水解进行应用，包括如下步骤：（1）木质纤维素的预处理：以常见农业秸秆为原料进行预处理，脱除木质素并提取秸秆纤维；（2）热纤梭菌的厌氧发酵：将热纤梭菌工程菌依次进行种子培养、厌氧发酵，得到发酵液；（3）纤维水解：将步骤（2）所得发酵液复配其它纤维素酶对步骤（1）处理得到的秸秆纤维进行水解。
[0015]优选的，所述步骤（1）中，木质纤维素的预处理具体过程为：将秸秆原料洗净切碎，在碱性条件下进行水热反应，充分脱除木质素后，提取秸秆纤维，脱水并充分洗去残留碱液；所述碱为氢氧化钠与亚硫酸钠；所述氢氧化钠的重量：秸秆原料绝干重为1:（4
‑
6），所述亚硫酸钠：氢氧化钠的重量比为1:（3
‑
5）；处理条件为：反应温度为150
‑
160℃，时间为1
‑
3 h。
[0016]优选的，所述步骤（2）中，种子培养和厌氧发酵的过程为：A.种子培养：将从
‑
80℃保藏的热纤梭菌工程菌的菌种置于4℃冰箱解冻，无菌条件下吸取1 mL菌种注入种子培养基中，55℃、200 rpm条件下培养16
‑
24 h；B.厌氧发酵：随后以5%
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10%（v/v）的接种量接入发酵培养基中，55℃、200 rpm下培养16
‑
24 h。
[0017]优选的，所述步骤（2）的培养基包括体积比为40:2:1:1:1的A液、B液、C液、D液和E液，其中，A液为5 g/L碳源与10.00 g/L MOPS；B液为50.00 g/L柠檬酸三钾、31.25 g/L一水合柠檬酸、25.00 g/L Na2SO4、25.00 g/L KH2PO4、62.50 g/L NaHCO3；C液为250.00 g/L尿素、D液为50.00 g/L MgCl2·
6H2O、10.00 g/L CaCl2·
2H2O、5.00 g/L FeCl2·
4H2O、50.00 g/L L
‑
半胱氨酸盐酸盐；E液为1.00 g/L吡哆胺二盐酸盐、0.20 g/L对氨基苯甲酸、0.10 g/L生物素、0.10 g/L VB
12
。
[0018]更进一步优选的，种子培养基中A液的碳源为5.00 g/L微晶纤维素，发酵培养基中的碳源为5.00 g/L的秸秆纤维，更优选为步骤（1）制得的秸秆纤维。
[0019]优选的，所述步骤（3）中，纤维水解的具体步骤为：pH 4.5
‑
5.5，固液比1:(10
‑
30)，反应温度45
‑
55℃，单位质量秸秆纤维投加上述热纤梭菌发酵液10
‑
20 mL、纤维素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株，其特征在于：所述菌株为带有用于重组表达纤维膨胀蛋白基因Clocl
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1298的热纤梭菌工程菌。2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于：所述菌株为将热纤梭菌cel9K中SEQ ID No:1的核苷酸序列替换为纤维膨胀蛋白基因Clocl
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1298重组得到的工程菌。3.根据权利要求1或2所述的工程菌株，其特征在于：所述纤维膨胀蛋白基因Clocl
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1298来源于克莱弗雷梭菌（Clostridium clarifavum）DSM19732。4.权利要求1所述的可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株的构建方法，其特征在于：将纤维膨胀蛋白基因Clocl_1298重组表达到热纤梭菌基因组上，得到可以分泌纤维膨胀蛋白的工程菌株。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：将热纤梭菌基因组上cel9K基因中如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列替换为纤维膨胀蛋白基因Clocl
‑
1298的基因序列，得到重组热纤梭菌工程菌。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：张天元，邵雄俊，薛怡芸，
申请(专利权)人：苏州聚维元创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：