一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术首次鉴定出里氏木霉内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖转运蛋白四种功能的基因；并首次通过改造上述四种内源基因的表达强度，构建出大量生产L

【技术实现步骤摘要】
一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，特别是涉及一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用。

技术介绍

[0002]苹果酸，学名2
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羟基丁二酸，是一种重要的四碳二元羧酸。苹果酸的分子中有一个不对称的C原子，由此存在三种形式的苹果酸：L
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苹果酸、D
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苹果酸与D/L
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苹果酸。天然存在的苹果酸属于L
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苹果酸，在微生物、动物植物和细胞中分布广泛。
[0003]在食品和饮料工业中，L
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苹果酸被广泛用作酸味剂和风味增强剂。与柠檬酸相比，L
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苹果酸酸度更大、味道更柔和、滞留更持久，被认为是最好的食品酸味剂。在医药行业中，L
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苹果酸作为三羧酸循环中的中间产物，直接参与人体的新陈代谢中，具有保护人体的肾脏、肝脏、心脏的作用，及用于降低抗癌药物对普通细胞的毒副作用；L
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苹果酸也被加入药片中，使其具有水果天然酸味；苹果酸还可以配入氨基酸溶液中，来提高氨基酸吸收率等。在化工领域，L
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苹果酸可以作为牙膏中的清洁剂及烟草中除臭剂，焊锡中的助焊剂，各种金属容器的除锈剂，染料工业中的增效剂和护色剂；在高聚物材料领域，L
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苹果酸也是合成聚苹果酸的前体物质；在化学合成领域，L
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苹果酸可以转化为许多高价值的生物基化学品。2004年起，美国能源部将苹果酸确定为12种基本化学物质之一。
[0004]L
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苹果酸的生产方法有：直接提取法、酶转化法、化学合成法和微生物发酵法。直接提取法：是最早大量制备L
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苹果酸的方法，其原理是在富含L
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苹果酸的果汁中加入碳酸钙，使其沉淀为L
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苹果酸钙盐，收集后用硫酸溶解，得到L
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苹果酸。这一方法虽然工艺简单，产物纯度高，但原料来源有限、原料中L
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苹果酸含量相对少、成本高等原因，批量生产有困难。酶转化法：是指以富马酸为底物，在特定条件下以富马酸酶为生物催化剂，将其转化为L
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苹果酸。酶转化法生产L
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苹果酸可以实现连续、高效的工业化生产，是工业上生产L
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苹果酸的主要方式。但是该技术以石油基产品富马酸为原料，对环境不友好，及存在成本高和产品含有杂酸的缺点。化学合成法：主要有高温高压水合法、水解法、糠醛氧化法等。高温高压水合法是最常用的化学合成苹果酸的方法，已被用于苹果酸的工业化。高温高压水合法其步骤是以苯为原料，经催化氧化得到顺丁烯二酸，加热至120℃生成D/L
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苹果酸的混合物，不是纯的L
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苹果酸。生物发酵法：以糖质为原料，利用微生物的L
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苹果酸合成途径，得到目标产物L
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苹果酸。该法生产L
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苹果酸具有原料来源丰富、条件温和、安全性高、对环境友好等优点，被认为是最具有发展前途的生产方式，但目前该法还未应用于工业化大量生产中。
[0005]里氏木霉是重要的工业生产菌株，符合GRAS(Generally Regarded as Safe)标准，其发酵产物已被广泛应用于食品、饲料等行业。已知里氏木霉菌株不能发酵生产L
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苹果酸，可以通过转基因改造，引入外源基因，整合到里氏木霉的基因组上，构建转基因的里氏木霉工程菌，使其具备发酵生产L
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苹果酸的能力，但是可能会带来转基因操作的安全性和转基因食品政策的限制性等问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。该方法在不添加任何外源基因的前提下，通过强化自身的L
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苹果酸转运系统及胞质rTCA途径，提高L
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苹果酸的转运及合成能力，构建出不含有任何外源基因序列的高产L
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苹果酸的改良株。改良株属于非转基因物种，其生产的L
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苹果酸属于非转基因食品，避免了转基因涉及的安全性和政策的限制性等问题，也为微生物发酵来源的L
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苹果酸提供了非转基因的新方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0008]本专利技术提供一种非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株，以丝状真菌里氏木霉菌或者里氏木霉菌的衍生菌为出发菌株，在不引入任何外源基因的前提下，对所述出发菌株的基因组定向分子改良，使所得的里氏木霉改良株能够生产L
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苹果酸。
[0009]优选的是，对所述出发菌株的基因组定向分子改良，包括：通过同源比对鉴定出发菌株内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖转运蛋白的编码基因；过表达所鉴定的出发菌株内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶和葡萄糖转运蛋白的编码基因中的至少一种。
[0010]优选的是，所述里氏木霉菌包括里氏木霉菌株QM6a，QM9414，Rut
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C30，RL
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P37，NG14或PC
‑3‑
7。
[0011]本专利技术还提供一种获取所述的改良株的方法，包括以下步骤：利用里氏木霉菌内源的强启动子过表达所述里氏木霉菌内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶和葡萄糖转运蛋白的编码基因中的至少一种。
[0012]优选的是，所述里氏木霉菌内源的四碳二元羧酸转运蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的丙酮酸羧化酶的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的苹果酸脱氢酶的编码基因包括如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：23所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的苹果酸酶的编码基因包括如SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：29所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的葡萄糖转运蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35所示序列的基因。
[0013]优选的是，所述里氏木霉菌内源的强启动子包括里氏木霉菌丙酮酸脱羧酶基因的启动子和里氏木霉菌烯醇化酶基因的启动子。
[0014]本专利技术还提供利用所述的改良株生产L
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苹果酸的方法，包括将非转基因的里氏木霉改良株接种液体培养基中发酵培养，获取L
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苹果酸。
[0015]优选的是，所述液体发酵培养基包括如下浓度的组分：碳源50
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100g/L，蛋白胨6g/L，KH2PO
4 0.15g/L，K2HPO
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株，其特征在于，以丝状真菌里氏木霉菌或者里氏木霉菌的衍生菌为出发菌株，在不引入任何外源基因的前提下，对所述出发菌株的基因组定向分子改良，使所得的里氏木霉改良株能够生产L
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苹果酸。同时，改良株属于非转基因物种，其生产的L
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苹果酸属于非转基因食品。2.如权利要求1所述的改良株，其特征在于，对所述出发菌株的基因组定向分子改良，包括：通过同源比对鉴定出发菌株内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖转运蛋白的编码基因；过表达所鉴定的出发菌株内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶和葡萄糖转运蛋白的编码基因中的至少一种。3.如权利要求1所述的改良株，其特征在于，所述里氏木霉菌包括里氏木霉菌株QM6a，QM9414，Rut
‑
C30，RL
‑
P37，NG14或PC
‑3‑
7。4.一种获取如权利要求1所述的改良株的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用里氏木霉菌内源的强启动子过表达所述里氏木霉菌内源的四碳二元羧酸转运蛋白、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶和葡萄糖转运蛋白的编码基因中的至少一种。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述里氏木霉菌内源的四碳二元羧酸转运蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的丙酮酸羧化酶的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的苹果酸脱氢酶的编码基因包括如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：23所示序列的基因；所述里氏木霉菌内源的苹果酸酶的编码基因包括如SEQ ID NO：26和SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玮，
申请(专利权)人：王玮，
类型：发明
国别省市：