一种耐酸和耐Na制造技术

本发明专利技术公开了一种耐酸和耐Na

【技术实现步骤摘要】
一种耐酸和耐Na
+
的出芽短梗霉工程菌及发酵方法和L
‑
苹果酸提取方法


[0001]本专利技术涉及发酵了领域，具体涉及一种耐酸和耐Na
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的出芽短梗霉工程菌，还涉及利用工程菌发酵方法和发酵液中L
‑
苹果酸提取方法。

技术介绍

[0002]出芽短梗霉(Aureobasidum pullulan)是一种类酵母真菌，主要代谢产生聚苹果酸、普鲁兰多糖、黑色素等代谢产物。聚苹果酸(Polymalic acid)以L
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苹果酸为唯一单体聚合而成，是一种新型完全生物降解性高分子材料，具有高度的生物可降解性、易修饰性和生物可吸收性等优点，可用于药物缓控释载体、组织工程、食品加工等领域。而聚苹果酸水解产生的苹果酸单体具有酸味柔和、易吸收等特点，则更多地用于食品酸味剂和保健品。
[0003]传统有机酸发酵通常在发酵过程添加过量中和剂CaCO3维持近中性环境，但在后续提取过程产生CaSO4钙渣，造成下游环境污染。因此，急需一种发酵阶段不添加CaCO3，同时在提取过程中不引入有机溶剂和CaCO3，不产生钙渣等副产物的有机酸全流程发酵及提取的清洁生产方法。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供耐酸和耐Na
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的出芽短梗霉工程菌；利用球孢白僵菌(Beauveria bassinana)是一种具有广泛环境适应性的昆虫病原真菌，其对环境胁迫的高适应性与钙调磷酸酶相关，将球孢白僵菌中调控环境抗逆性的关键作用蛋白钙调磷酸酶转化到出芽短梗霉中，增强了其对低pH和高浓度Na
+
的适应能力，本专利技术的目的之二在于提供低酸发酵出芽短梗霉的方法，以Na2CO3为中和剂控制低pH发酵，将实现减少中和剂用量并降低生产成本。本专利技术还提供了一种直接水相结晶提取工艺，无钙渣排放的同时获得了高收率高纯度的L
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苹果酸。
[0005]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]1、一种耐酸和耐Na
+
的出芽短梗霉工程菌，所述工程菌为在出芽短梗霉中表球孢白僵菌钙调磷酸酶基因。
[0007]本专利技术优选的，所述球孢白僵菌钙调磷酸酶基因为球孢白僵菌钙调磷酸酶can基因、球孢白僵菌钙调磷酸酶cnab基因或球孢白僵菌钙调磷酸酶cnb基因。
[0008]本专利技术优选的，所述球孢白僵菌钙调磷酸酶can基因的核苷酸如SEQ ID NO.1所示；所述球孢白僵菌钙调磷酸酶cnab基因的核苷酸如SEQ ID NO.2所示；所述球孢白僵菌钙调磷酸酶cnb基因的核苷酸如SEQ ID NO.3所示。
[0009]2、利用所述工程菌发酵的方法，将活化的工程菌进行发酵，然后以Na2CO3控制pH，发酵后收集发酵液。
[0010]本专利技术优选的，所述工程菌的制备方法如下：将球孢白僵菌钙调磷酸酶基因以构巢曲霉PgpdA强启动子和TtrpC终止子构成完整表达盒，然后连入pK2
‑
Nour的EcoR I酶切位
点处，得到重组表达载体，然后将重组表达载体通过根癌农杆菌介导转化出芽短梗霉细胞，筛选阳性克隆得到过量表达球孢白僵菌钙调磷酸酶基因的出芽短梗霉工程菌。
[0011]本专利技术优选的，发酵中Na2CO3控制pH至2.5～5。
[0012]本专利技术优选的，所述发酵使用的碳源为木糖或葡萄糖。
[0013]本专利技术优选的，所述发酵条件为25℃、转速为400～700rpm，通气比1:0.8～1:1.6，培养至碳源浓度小于10g/L。
[0014]3、一种L
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苹果酸提取方法，将所述方法得到的发酵液的先进行固液分离收集滤液，然后去除色素杂质，浓缩后进行酸水解，依次去除Na
+
和SO
42
‑
后，加入晶种结晶，冷冻干燥得到白色粉末的L
‑
苹果酸。
[0015]本专利技术优选的，所述固液分离为使用陶瓷膜，跨膜压力0.1～0.2Mpa，收集滤液；
[0016]所述脱色为瀚宇HYA
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115脱色树脂，流速为1
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2BV/h，收集滤液；
[0017]所述酸水解为将滤液在温度为50～70℃下浓缩，浓缩比为5～20，加入浓缩液体积0.4
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2倍的2mol/L H2SO4，在70
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90℃水解8
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14h；
[0018]所述去除Na
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的方法为用苯乙烯阳离子树脂，流速为1
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2BV/h，去除SO
42
‑
用阴离子树脂除去SO
42
‑
，流速1
‑
2BV/h；
[0019]所述结晶为将滤液在温度为50
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70℃，浓缩比80
‑
200，加入相当于浓缩液质量0.5
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4％(m/v)的晶种后于4℃结晶36
‑
96小时。
[0020]本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了耐酸和耐Na
+
的出芽短梗霉工程菌，通过异源表达球孢白僵菌的钙调磷酸酶，提高了出芽短梗霉对低pH和高浓度Na
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的耐受能力，本专利技术还提供了该工程菌低酸发酵出芽短梗霉的方法，发酵过程中通过加入少量中和剂生产聚苹果酸的能力，本专利技术还设计了一种直接水相晶体提取工艺，提取过程中没有钙渣环境污染，提高了L
‑
苹果酸的收率。
附图说明
[0021]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：
[0022]图1为耐受性测试生长曲线(A：低pH耐受性测试；B：高浓度Na
+
耐受性测试)。
具体实施方式
[0023]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0024]实施例1、球孢白僵菌钙调磷酸酶基因异源表达
[0025](1)异源表达载体构建：将含有构巢曲霉PgpdA强启动子、球孢白僵菌钙调磷酸酶基因can或cnab或cnb、TtrpC终止子的完整表达盒连入pK2
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Nour的EcoR I酶切位点处，分别构建异源表达载体pK2
‑
Nour
‑
can、pK2
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Nour
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cnab和pK2
‑
Nour
‑
cnb。can或cnab或cnb基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7所示，编码区序列如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8所示；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3,SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐酸和耐Na
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的出芽短梗霉工程菌，其特征在于：所述工程菌为在出芽短梗霉中表球孢白僵菌钙调磷酸酶基因。2.根据权利要求1所述耐酸和耐Na
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的出芽短梗霉工程菌，其特征在于：所述球孢白僵菌钙调磷酸酶基因为球孢白僵菌钙调磷酸酶can基因、球孢白僵菌钙调磷酸酶cnab基因或球孢白僵菌钙调磷酸酶cnb基因。3.根据权利要求1所述耐酸和耐Na
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的出芽短梗霉工程菌，其特征在于：所述球孢白僵菌钙调磷酸酶can基因的核苷酸如SEQ ID NO.1所示；所述球孢白僵菌钙调磷酸酶cnab基因的核苷酸如SEQ ID NO.2所示；所述球孢白僵菌钙调磷酸酶cnb基因的核苷酸如SEQ ID NO.3所示。4.利用权利要求1～3任一项所述工程菌发酵的方法，其特征在于：将活化的工程菌进行发酵，然后以Na2CO3控制pH，发酵后收集发酵液。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述工程菌的制备方法如下：将球孢白僵菌钙调磷酸酶基因以构巢曲霉PgpdA强启动子和TtrpC终止子构成完整表达盒，然后连入pK2
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Nour的EcoR I酶切位点处，得到重组表达载体，然后将重组表达载体通过根癌农杆菌介导转化出芽短梗霉细胞，筛选阳性克隆得到过量表达球孢白僵菌钙调磷酸酶基因的出芽短梗霉工程菌。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：发酵中Na2CO3控制pH至2.5～5。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵使用的碳源为木糖或葡萄糖。8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵条件为25℃、转速为400～700rpm，通气比1:0.8～...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹祥，李白月，徐兴然，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：