一种海藻酸裂解酶高产菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体提供了一种高产海藻酸裂解酶的里氏木霉（Trichoderma reesei）菌株。申请人首先构建得到重组表达海藻酸裂解酶的里氏木霉工程菌株，然后通过紫外诱变的方法筛选获得一株海藻酸裂解酶产量得到显著提高的突变菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2021994。所述突变菌株可以广泛应用于海藻酸裂解酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种海藻酸裂解酶高产菌株及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程与微生物工程改造
，具体涉及一种海藻酸裂解酶高产菌株及其应用。

技术介绍

[0002]藻类是一种没有真正的根茎叶和维管束的水生植物，属于原生生物界，能进行光合作用。褐藻中含有蛋白质，矿物质，膳食纤维，脂质和维生素，具有很高的营养价值和药用价值。因此，褐藻常被用作食品添加剂，并且用于癌症、心脏病、肺病等疾病的治疗。由于其碳水化合物含量高，褐藻也是原料生物质的有潜力来源。
[0003]褐藻主要由褐藻胶、昆布多糖、甘露醇和褐藻多糖硫酸酯等组成。其中，褐藻胶是来源于褐藻细胞壁的一种阴离子多糖，是褐藻中主要的结构成分，也称为海藻酸钠或褐藻酸钠。利用褐藻首先要解决利用褐藻胶的问题。
[0004]褐藻胶的降解方法主要有：（1）化学降解。酸、水热或碱预处理已经被用于褐藻胶的水解，化学降解中酸水解比较常用，但是褐藻胶相对耐酸，并且难以控制糖醛酸生产。另外，需要高浓度的酸来获得高产率的糖醛酸。（2）水热预处理。褐藻胶经水热预处理（180
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240℃）可产生褐藻胶单体（甘露糖醛酸盐和古洛糖醛酸盐），同时产生乳酸和乙醇酸等物质。（3）酶法降解。在20世纪60年代首次报道的细菌藻酸盐代谢途径中，线性褐藻胶多糖链首先被两种海藻酸裂解酶解聚。内切型海藻酸裂解酶产生具有不同DP的褐藻胶寡糖，而外切型酶降解褐藻胶或褐藻胶低聚糖产生单糖。
[0005]海藻酸裂解酶催化藻酸盐的降解，α
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L
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古洛糖醛酸盐及其C5差向立体β
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D
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甘露糖醛酸盐的复合共聚物。这些酶已经从具有不同底物特异性的各种生物中分离出来，包括藻类、海洋软体动物、海洋和陆生细菌以及一些病毒和真菌等。这些生物体大多数都能够利用褐藻胶的降解产物Ｍ和Ｇ模块作为碳源和能量来源。特别有趣的现象是在可以合成褐藻胶的细菌中也可以产生海藻酸裂解酶，具有这种现象的细菌主要包括几种假单胞菌和固氮菌。另外，在某些噬菌体中也发现了海藻酸裂解酶。
[0006]海藻酸裂解酶可被用于生物功能性褐藻胶寡糖的制备，据报道，由海藻酸裂解酶制备的褐藻胶寡糖具有多种生物活性，褐藻胶裂解藻酸盐得到的低聚糖，可调节植物和微生物的生理过程，如促进双歧杆菌的生长，增强植物的萌发和枝条伸长。褐藻胶低聚糖还表现出许多生理活性，如抗肿瘤，刺激细胞因子的产生，调节血脂和降血糖等。在医用方面，使用海藻酸裂解酶可以增加抗生素在呼吸道中的效力，因为海藻酸裂解酶能降解由铜绿假单胞菌产生的胞外海藻酸盐。研究表明，当海藻酸裂解酶与庆大霉素等抗生素共同给药时，可增加呼吸道黏液型铜绿假单胞菌的杀伤效力。在生物燃料和生物化学品的生产方面，海藻酸裂解酶可将藻酸盐转化为不饱和单糖或寡糖，其可分解为丙酮酸和甘油醛
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磷酸，然后通过引入相关基因和代谢工程将丙酮酸转化成各种生物燃料和生物化学品。
[0007]由于目前海藻酸裂解酶产量较低、成本高，不能进行大规模的商业化生产，因此，寻找一种性状稳定、易于培养的高产海藻酸裂解酶菌株成为研究的关键。

技术实现思路

[0008]本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种高产海藻酸裂解酶的里氏木霉（Trichoderma reesei）菌株。申请人首先构建得到重组表达海藻酸裂解酶的里氏木霉工程菌株，然后通过紫外诱变的方法筛选获得一株海藻酸裂解酶产量得到显著提高的突变菌株，可广泛应用于海藻酸裂解酶的生产。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术一方面提供了一种里氏木霉工程菌，所述菌株携带有表达海藻酸裂解酶基因的重组载体。
[0010]所述的海藻酸裂解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
[0011]本专利技术一方面提供了一种突变菌株，命名为里氏木霉AH（Trichoderma reesei AH），已于2021年8月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2021994。
[0012]本专利技术还提供了所述里氏木霉突变菌株在生产海藻酸裂解酶中的应用。
[0013]本专利技术通过紫外诱变筛选获得的突变菌株里氏木霉AH，其海藻酸裂解酶产量得到大幅提升，20L罐发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活高达982U/ml，比出发菌株提高了153％，取得了意料不到的技术效果。所述里氏木霉突变菌株可广泛应用于海藻酸裂解酶的生产，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在食品和饲料加工等领域中的推广与应用。
附图说明
图1为温度
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相对酶活曲线；图2为pH
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相对酶活曲线。
具体实施方式
[0014]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本专利技术不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。
[0015]下面结合具体的实施方式对本专利技术进行详细描述。
[0016]实施例1 海藻酸裂解酶重组表达菌株的构建申请人根据里氏木霉（Trichoderma reesei）密码子偏好性对海藻酸裂解酶基因AH进行密码子优化，优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，由北京六合华大基因科技有限公司合成，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
[0017]以合成的核苷酸序列为模板，利用引物AH
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F和AH
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R扩增出AH基因片段。
[0018]PCR引物序列如下：AH
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F：ATCGGTACCATGAAGATCAACCGCCTCCTCCCC；AH
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R：TTAACGCGTTTAGTCGTGGGTGTGTTCGAGGCT。
[0019]反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸120s，30个
循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，AH基因为大小1731bp的片段。
[0020]将上述获得的AH基因片段与表达载体pC1E分别用限制性内切酶KpnI和MluI进行双酶切，并胶回收目的片段，将胶回收得到的AH基因双酶切片段和表达载体pC1E双酶切片段用T4DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布于LB+Amp平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到重组表达质粒pC1E
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AH。
[0021]原生质体制备：取宿主菌里氏木霉（Trichoderma reesei）U本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种里氏木霉工程菌，其特征在于，所述的里氏木霉工程菌携带有重组表达海藻酸裂解酶基因的表达载体。2.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌，其特征在于，所述海藻酸裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。3.一种里氏木霉突变菌，其特征在于，所述的里氏木霉突变菌是以权利要求2所述的里氏木...

【专利技术属性】
技术研发人员：李瑞，许丽红，宋清清，裴晓洁，李玉强，王华明，
申请(专利权)人：权利要求书一页说明书五页序列表四页附图一页，
类型：发明
国别省市：