一种南极适冷真菌突变方法及常温适应突变株的筛选技术

本发明专利技术提供了一种南极适冷真菌突变方法及常温适应突变株的筛选。所述方法基于转座子系统的诱变。本发明专利技术的方法可高效获得南极适冷真菌的原生质体以及高效获得转化子，为基于转座子系统的菌株突变改造夯实了基础。同时，本发明专利技术也提供了有效突变菌株Geomyces sp.MP10，其为常温适应突变株，其在常温下具有良好的产紫红色素的能力。紫红色素的能力。

【技术实现步骤摘要】
一种南极适冷真菌突变方法及常温适应突变株的筛选


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于转座子系统的南极适冷真菌突变筛选的技术方法，本专利技术也涉及一株有效突变菌株Geomyces sp.MP10。

技术介绍

[0002]南极由于极端的气候条件——极低温、季风、辐射、反复冻融等，形成了独一无二的生态环境，同时造就了极地微生物独特的生理生化特性，这些特性随着时间的积累，逐渐构成了极地丰富的微生物资源库。与极地微生物资源库庞大的数量相比，真正得到开发应用的例子却凤毛麟角，大部分研究专注于功能活性产物的单一筛选及功能研究，其中很大一部分原因在于，极地微生物很多具有独特生理生化活性的代谢产物，均需要在一定条件下才能正常生产，如低温，高湿度，高盐度等。特殊的生产条件造就了代谢产物独特的生物活性，但也限制着产物进一步的大规模开发与应用，如何平衡二者的关系，成为了探索极地微生物资源宝库的一把重要钥匙。
[0003]南极适冷真菌Geomyces sp.WNF
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15A是在南极土壤中分离出来的一株丝状真菌，在低温的培养条件下可以分泌胞外水溶性紫红色素。Geomyces sp.WNF
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15A生产的紫红色素色价高，各方面稳定性好，且不含对人类致病的过敏原，是具有巨大应用价值的高潜力菌株。此外，Geomyces sp.WNF
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15A也具有显著的适冷真菌生理特性，即低温高产，最适生产温度为14℃，在20℃条件下培养，色素产量降低80％左右。因此，本领域亟待研究优化其性能或对其进行优化改造的方案，来获得温度适应性更为理想且产素效果好的菌株。然而，南极适冷真菌的细胞壁、细胞膜与普通菌株存在差异，其原生质体的获得以及转化子的获得非常困难，一定程度上限制了其优化改造进程。
[0004]在微生物功能基因的鉴定以及遗传育种的研究中，随机突变体的应用是非常重要的。常规突变体的筛选有三类方法：物理诱变，化学诱变以及生物诱变。物理诱变主要通过放射性的物理因素对基因造成随机破坏，然后依赖宿主自我修复形成突变体或是造成生物体内结构成分的电离、激发从而形成结构变化；化学诱变则是通过性质不稳定的化学试剂，通过原子基团的置换等或者核酸类似物的替换等使基因序列发生突变。这两类突变方法随机性大，效率较低，且难以对功能基因进行后续的研究分析。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种南极适冷真菌突变方法及常温适应突变株的筛选。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供一种突变型紫红色素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2021561。
[0007]在一个或多个实施方式中，所述紫红色素生产菌株的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其中含有紫红色素，或其能够产生紫红色素。
[0008]在本专利技术的另一方面，提供所述的突变型紫红色素生产菌株或其细胞培养物、细
胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的应用，用于生产紫红色素。
[0009]在一个或多个实施方式中，所述紫红色素为呈现紫红色的色素，作为食品添加剂或工业添加剂。
[0010]在一个或多个实施方式中，所述应用包括常温(不高于25℃，如16～25℃，较佳地18～25℃，更佳地20～25℃；更具体如21、22、24℃)或低温(如低于15℃，如0～15℃；更具体如1、2、3、5、6、8、10、12、14℃)下的应用。
[0011]在本专利技术的另一方面，提供一种用于生产或分离紫红色素的组合物，其包含所述的突变型紫红色素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物；以及微生物学上、食品学上或工业上可接受的载体。
[0012]在本专利技术的另一方面，提供一种应用所述的突变型紫红色素生产菌株生产紫红色素的方法，包括：在常温下发酵培养所述紫红色素生产菌株，生产紫红色素。
[0013]在一个或多个实施方式中，所述的紫红色素生产菌株在接种于发酵培养基前还包括：将该菌株进行预先活化、扩大培养，之后接种入发酵培养基。
[0014]在一个或多个实施方式中，生产紫红色素的方法包括：
[0015](1)菌株活化；较佳地，将所述菌株接种至种子液体培养基，14～20℃培养2～5天，涂布于固体种子培养基平板，于14～20℃培养箱培养3～5d；
[0016](2)制备种子液；较佳地，每50mL种子培养基挖块接种直径为1.7～2cm的培养3～5d的种子平板菌块，130～200rpm培养2～3d，使种子培养基有成熟的孢子，得到一级种子液；接种量为体积百分比5～10％接种二级种子，130～200rpm培养24～36h，得到活性高的二级种子液；
[0017](3)发酵培养；较佳地，将种子液按6～10mg接种量(菌体干重)接种到50mL发酵培养基中，25℃130～200rpm发酵培养16d，离心，得到含胞外紫红色素的上清液。
[0018]在一个或多个实施方式中，所述方法还包括：从培养产物(发酵液)中提纯或分离紫红色素；更佳地包括：将完成发酵后的发酵液进行固液分离，取液体，得到胞外水溶性紫红色素。
[0019]在一个或多个实施方式中，所述的固体种子培养基包括：葡萄糖1g，甘露醇2g，麦芽糖2g，谷氨酸钠1g，酵母浸提物0.6g，MgSO4·
7H2O 0.03g，KH2PO40.05g，琼脂粉3g，用蒸馏水定容至100mL，pH自然。
[0020]在一个或多个实施方式中，所述的种子培养基包括：葡萄糖1g，甘露醇2g，麦芽糖2g，谷氨酸钠1g，酵母浸提物0.6g，MgSO4·
7H2O 0.03g，KH2PO
4 0.05g，用蒸馏水定容至100mL，pH自然。
[0021]在一个或多个实施方式中，所述的发酵培养基包括：淀粉2.8g，蛋白胨0.185g，用蒸馏水定容至100mL，pH自然。
[0022]在一个或多个实施方式中，所述的固液分离的方法为离心。
[0023]在本专利技术的另一方面，提供一种用于生产紫红色素的试剂盒，其中含有：容器，以及位于容器中的权利要求1所述的突变型紫红色素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物。
[0024]在本专利技术的另一方面，提供一种南极适冷真菌突变及常温适应突变株的筛选方法，所述方法基于转座子系统诱变，包括步骤：(1)建立转座子载体(包括克隆扩增以及纯
化)；较佳地，所述的转座子包括Fot1和/或Impala；更佳地还包括Helitron；(2)制备南极适冷真菌原生质体，其中利用含有纤维素酶和蜗牛酶的酶解液进行细胞壁的酶解(破壁酶解)；(3)将(1)的转座子载体转化(2)的原生质体，获得阳性转化子；(4)从(3)获得的阳性转化子中筛选常温适应突变株。
[0025]在一个或多个实施方式中，将载体导入野生型菌株后，载体会使得菌体基因组产生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变型紫红色素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2021561。2.权利要求1所述的突变型紫红色素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的应用，用于生产紫红色素。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述紫红色素为呈现紫红色的色素，作为食品添加剂或工业添加剂；或，所述的应用包括常温或低温下的应用。4.一种用于生产或分离紫红色素的组合物，其包含权利要求1所述的突变型紫红色素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物；以及微生物学上、食品学上或工业上可接受的载体。5.一种应用权利要求1所述的突变型紫红色素生产菌株生产紫红色素的方法，包括：在常温下发酵培养所述紫红色素生产菌株，生产紫红色素；较佳地，所述的紫红色素生产菌株在接种于发酵培养基前，还包括：将该菌株进行预先活化、扩大培养，之后接种入发酵培养基；更佳地，生产紫红色素的方法包括：(1)菌株活化；较佳地，将所述菌株接种至种子液体培养基，14～20℃培养2～5天，涂布于固体种子培养基平板，于14～20℃培养箱培养3～5d；(2)制备种子液；较佳地，每50mL种子培养基挖块接种直径为1.7～2cm的培养3～5d的种子平板菌块，130～200rpm培养2～3d，使种子培养基有成熟的孢子，得到一级种子液；接种量为体积百分比5～10％接种二级种子，130～200rpm培养24～36h，得到活性高的二级种子液；(3)发酵培养；较佳地，将种子液按6～10mg接种量接种到50mL发酵培养基中，25℃130～200rpm发酵培养16d，离心，...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡孟浩，丁璐璐，卢凤宁，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：