单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针制造技术

本发明专利技术公开一种单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物医学检测技术领域。本发明专利技术提供的试剂盒包括针对HSV

【技术实现步骤摘要】
单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种单纯疱疹病毒1型(HSV
‑
1)和2型(HSV
‑
2)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，特别是涉及使用特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Test，SAT)结合的单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

技术介绍

[0002]单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是一类严重危害人类健康、引起皮肤病和性病的病毒性病原体，是引起生殖器疱疹最常见的原因，人是其唯一的自然宿主，人群感染高达80
‑
90％，10％无症状。根据抗原性不同，可将HSV分为HSV
‑
1型和HSV
‑
2型。HSV
‑
1主要引起腰以上部位(如眼、口、唇的皮肤黏膜)以及中枢神经系统的感染，一般通过口腔及污染的手及飞沫感染，感染多见于儿童，常引起口腔齿龈和口腔炎，多为隐性感染，并不表现出症状。HSV
‑
2主要引起生殖器部位的皮肤黏膜及新生儿感染，引起生殖器疱疹，发作时生殖器周围出现疼痛性皮肤疱疹损害，并容易复发。由于许多HSV感染者缺乏典型的临床表现(比如出现自限性、复发性、疼痛性的水疱或溃疡性皮疹)，且HSV感染者的预后取决于所感染的HSV类型(HSV
‑
1或HSV
‑
2)，因此对HSV的分型诊断具有重要的临床和流行病学意义。
[0003]目前，对HSV进行检测的方法主要包括实时荧光PCR技术，例如专利文献CN101979667A(以下称文献1)公开一种同步检测单纯疱疹病毒I型和II型的荧光定量PCR试剂盒，其包括分别用于检测HSV
‑
1和HSV
‑
2的引物和探针，能够同步高特异性和高灵敏度(10copies/50μL)检出体系中的HSV
‑
1和HSV
‑
2。又如专利文献CN112063749A(以下称文献2)公开一种用于鉴定单纯疱疹病毒的引物探针组合以及荧光定量PCR试剂盒，其包括分别用于检测HSV
‑
1和HSV
‑
2的引物和探针，能够高灵敏度(最低拷贝数为100copies/μL)、高特异性和高效率检出体系中的HSV
‑
1和HSV
‑
2。然而，上述文献1和文献2公开的方法均基于荧光PCR的基本原理，其在PCR反应过程中需要温度的升降和循环，因此所需检测时间较长(一般需要2
‑
3小时)，效率较低；另外，PCR的反应产物为DNA，不易降解，容易导致样本交叉污染和实验环境的污染。
[0004]虽然本领域已存在基于核酸恒温扩增检测技术的单纯疱疹病毒的检测方法，例如专利文献CN105624329A(以下称文献3)公开一种单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其基于荧光核酸恒温扩增检测原理可实现对单纯疱疹病毒1型的高特异性和高灵敏度检测。又如专利文献CN110923362A(以下称文献4)公开一种用于同时检测单纯疱疹病毒I型/II型胶体金层析试剂盒，其联合RNA恒温扩增技术和金探针层析技术实现对单纯疱疹病毒I型/II型核酸的高特异性和高灵敏度(对HSVI的最低检测限为8.0TCID50/mL，对HSVII的最低检测限为6.4TCID50/mL)检测。然而，上述文献3公开的方法只能检测HSV
‑
1，而不能同时检测HSV
‑
2并分型；上述文献4公开的方法存在以下缺陷：(1)在RNA恒温扩增之
后和层析检测之前，需要将RNA恒温扩增产物取出与包含探针的检测液预杂交混合，这一过程极易造成不同检测样本之间的交叉污染；(2)RNA恒温扩增之后的操作均需要人工操作，更容易造成人为操作失误，且效率较低；(3)该文献4公开的检测方法为终点检测法，只能定性获得RNA恒温扩增完成之后的检测结果，而不能实时反映RNA恒温扩增的状态。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的一个或多个问题，本专利技术一个方面提供一种单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其包括：
[0006](1)核酸提取液：其包含含有捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针用于捕获检测序列，包括用于捕获HSV
‑
1的检测序列的TCO
‑
11和用于捕获HSV
‑
2的检测序列的TCO
‑
21，所述第一引物用于与靶标序列特异性结合，包括用于与HSV
‑
1的靶标序列特异性结合的HSV
‑1‑
F1和用于与HSV
‑
2的靶标序列特异性结合的HSV
‑2‑
F1；
[0007](2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列，其中所述第二引物包括与所述HSV
‑1‑
F1配合的HSV
‑1‑
R1和与所述HSV
‑2‑
F1配合的HSV
‑2‑
R1；
[0008](3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合，其中所述靶标检测探针包括针对HSV
‑
1的HSV
‑1‑
P1和针对HSV
‑
2的HSV
‑2‑
P1，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团；
[0009](4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
‑
MLV反转录酶；
[0010]其中：
[0011]所述TCO
‑
11包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，所述TCO
‑
21包含如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
[0012]所述HSV
‑1‑
F1包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述HSV
‑2‑
F1包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
[0013]所述HSV
‑1‑
R1包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述HSV
‑2‑
R1包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
[0014]所述HSV
‑1‑
P1包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述HSV
‑2‑
P1包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括：(1)核酸提取液：其包含含有捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针用于捕获检测序列，包括用于捕获HSV
‑
1的检测序列的TCO
‑
11和用于捕获HSV
‑
2的检测序列的TCO
‑
21，所述第一引物用于与靶标序列特异性结合，包括用于与HSV
‑
1的靶标序列特异性结合的HSV
‑1‑
F1和用于与HSV
‑
2的靶标序列特异性结合的HSV
‑2‑
F1；(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列，其中所述第二引物包括与所述HSV
‑1‑
F1配合的HSV
‑1‑
R1和与所述HSV
‑2‑
F1配合的HSV
‑2‑
R1；(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合，其中所述靶标检测探针包括针对HSV
‑
1的HSV
‑1‑
P1和针对HSV
‑
2的HSV
‑2‑
P1，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团；(4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M
‑
MLV反转录酶；其中：所述TCO
‑
11包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，所述TCO
‑
21包含如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；所述HSV
‑1‑
F1包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述HSV
‑2‑
F1包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；所述HSV
‑1‑
R1包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述HSV
‑2‑
R1包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；所述HSV
‑1‑
P1包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述HSV
‑2‑
P1包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相支持物为磁性颗粒。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：(5)洗涤液：其含有NaCl和SDS；和/或(6)矿物油；和/或(7)阳性对照：含有单纯疱疹病毒1型和2型核酸的体系；和/或(8)阴性对照：不含有单纯疱疹病毒1型和2型核酸的体系。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取液的组分包括：250
‑
800mM HEPES、4
‑
10％十二烷基硫酸锂、1
‑
50μΜ的TCO
‑
11、1
‑
50μΜ的TCO
‑
21、50
‑
500mg/L磁珠、25
‑
150pmol/mL的HSV
‑1‑
F1、25
‑
150pmol/mL的HSV
‑2‑
F1；所述检测液a的组分包括：10
‑
50mM Tris、5
‑
40mM KCl、10
‑
40mM MgCl2、1
‑
20mM NTP、0.1
‑
10mM dNTPs、1
‑
10％PVP40、250
‑
750pmol/mL的HSV
‑1‑
R1、250
‑
750pmol/mL的HSV
‑2‑
R1；所述检测液b的组分包括：10
‑
50mM Tris、5
‑
40mM KCl、10
‑
40mM MgCl2、1
‑
20mMNTP、0.1
‑
10mM dNTPs、1
‑
10％PVP40、143
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：居金良，崔振玲，朱兴华，张帝，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：