二联灭活疫苗相对效力的检测方法技术

本发明专利技术公开一种二联灭活疫苗相对效力的检测方法，涉及抗原检测技术领域，所述二联灭活疫苗为猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗，所述二联灭活疫苗相对效力的检测方法包括：采用免疫印迹法，测定所述二联灭活疫苗的相对效力。本发明专利技术提供的二联灭活疫苗相对效力的检测方法，可实现猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体两种抗原同步操作，排除不同缓冲体系中非蛋白类盐分与试剂，非有效抗原对检测的影响。非有效抗原对检测的影响。非有效抗原对检测的影响。

【技术实现步骤摘要】
二联灭活疫苗相对效力的检测方法


[0001]本专利技术涉及抗原检测
，特别涉及一种二联灭活疫苗相对效力的检测方法。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)属于猪圆环病毒属，病毒粒子直径14～17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.7kb。现已报道的有猪圆环病毒2型有四种基因型，其中PCV2已证实是猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)的主要病原之一，在世界范围里广泛流行，给养猪业造成严重经济损失。接种疫苗是预防该病的首要手段，基因工程亚单位疫苗因其良好的安全性而深受市场青睐，PCV2 ORF2基因编码的二十面体病毒衣壳蛋白(Cap蛋白)，是该病毒的主要抗原。通过重组表达Cap蛋白制备的亚单位疫苗，已获得市场认可。
[0003]猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia，Mhp)属于软壁菌门、软膜体纲、猪肺炎支原体目、猪肺炎支原体科、猪肺炎支原体属，感染后出现一种高发病率，低死亡率的慢性呼吸道传染病，目前仅发现感染猪，且不分日龄、性别或品种，对养猪业带来严重危害。防治该病的关键措施是疫苗接种，针对该病原的商品化灭活苗、减毒活苗己得到广泛应用。
[0004]猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体均可与多种病毒、细菌一起混合感染猪，加剧临床表现。二者相互作用更是猪场常见病原，有研究表明，猪肺炎支原体感染可加剧PCV2所致肺部和淋巴病变的严重程度、增加PCV2病原数量、延长PCV2病原的存在时间，从而提高断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的发病率。针对这两种病原的联苗也极大受到市场的欢迎。
[0005]猪圆环病毒2型Cap蛋白与猪肺炎支原体制备的二联灭活疫苗的抗原检测，多采用分别检测各抗原含量。猪圆环病毒2型部分多采用检测免疫动物后抗体水平、实验动物免疫攻毒法，或ELISA方法定量疫苗中Cap蛋白含量或免疫攻毒实验检验疫苗效力；猪肺炎支原体部分多采用免疫攻毒方法或ELISA法定量疫苗中猪肺炎支原体抗原含量。动物实验检测方法成本高，周期长，而且动物个体差异对结果影响大；ELISA法快捷，但疫苗中所含的缓冲体系，盐分，杂蛋白，佐剂等对检测的影响无法消除，批次间差异，对检测的影响一直存在。
[0006]因此，有必要开发新的猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗相对效力检验方法，以解决现有技术中存在的分步检测联苗不同抗原含量和杂蛋白，非蛋白成分对联苗中不同抗原含量检测的影响。

技术实现思路

[0007]本专利技术的主要目的是提出一种二联灭活疫苗相对效力的检测方法，旨在同步实现圆支二联苗相对效力检验，还可以排除溶液中非蛋白组分和非目的蛋白对样品检测的影响。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提出一种二联灭活疫苗相对效力的检测方法，所述二联灭活疫苗为猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗，所述二联灭活疫苗相对效力的检
测方法包括：采用免疫印迹法，测定所述二联灭活疫苗的相对效力。
[0009]可选地，步骤采用免疫印迹法，测定所述二联灭活疫苗的相对效力包括：
[0010]S10、制备多个不同浓度参考疫苗的变性蛋白样品，制备待测样品的变性蛋白样品，其中，所述参考疫苗包括猪圆环病毒2型参考疫苗和猪肺炎支原体参考疫苗；
[0011]S20、SDS
‑
PAGE分离参考疫苗和待测样品变性蛋白样品中的Cap蛋白，SDS
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PAGE分离参考疫苗和待测样品变性蛋白样品中的P46蛋白；
[0012]S30、将参考疫苗和待测样品的Cap蛋白从凝胶转移到PVDF膜上，得第一膜，将参考疫苗和待测样品的P46蛋白从凝胶转移到PVDF膜上，得第二膜；
[0013]S40、将所述第一膜和所述第二膜封闭后，分别加特异性抗体和酶标第二抗体并孵育，对应得第一待测膜和第二待测膜；
[0014]S50、将所述第一待测膜和所述第二待测膜显色后，分别测定灰度，并根据参考疫苗的灰度与对应浓度，获得标准曲线；
[0015]S60、根据所述各待测样品的灰度，在标准曲线上获得待测样品的相对浓度，并依据所述待测样品的相对浓度和对应参考疫苗样品的相对浓度，获得待测样品的相对效力。
[0016]可选地，在步骤S10中，所述不同浓度的参考疫苗的制备方法包括：
[0017]猪圆环病毒2型参考疫苗和猪肺炎支原体参考疫苗分别采用0.01mol/LPBS进行稀释，稀释倍数为300倍～3000倍，以获得不同浓度的参考疫苗免疫印迹法检测的线性范围。
[0018]可选地，在步骤S40中，所述特异性抗体包括猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪肺炎支原体菌体上的P46蛋白的特异性单抗。
[0019]可选地，在步骤S40中，所述酶标第二抗体包括HRP标记的二抗。
[0020]可选地，在步骤S40中，所述封闭使用的封闭液为含脱脂奶粉的TBS。
[0021]可选地，在步骤S50中，所述显色为ECL化学显色。
[0022]可选地，步骤S50中，所述标准曲线的R2≥0.99；所述标准曲线上，至少有三个连续的点。
[0023]可选地，步骤S60中，所述在标准曲线上获得待测样品的相对浓度，需在建立标准曲线方程的连续点的阀值范围内，且至少两个样品重复检测值之间的差异系数小于10％；所述待测样品的相对效力＝所述待测样品的相对浓度/对应参考疫苗样品的相对浓度。
[0024]本专利技术提出的二联灭活疫苗相对效力的检测方法，采用分子生物学免疫印迹技术，利用特异性强的单抗作为检测的反应体系，可有效解决非目的杂蛋白对检测的影响，可直接检测到目的抗原含量，对于实际应用的指导意义更大；配合商品化的HRP标签二抗放大效应，可更准确的反映目的抗原含量。本专利技术提供的二联灭活疫苗相对效力的检测方法，可实现猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体两种抗原同步操作，排除不同缓冲体系中非蛋白类盐分与试剂，非有效抗原对检测的影响。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0026]图1为本专利技术实施例中猪肺炎支原体参考疫苗标准曲线最适线性稀释倍数研究；
[0027]图2为本专利技术实施例中猪圆环病毒2型参考疫苗标准曲线最适线性稀释倍数研究；
[0028]图3为本专利技术实施例中PCV2 Cap蛋白单抗的IPMA鉴定图；
[0029]图4为本专利技术实施例中猪肺炎支原体P46蛋白单抗的鉴定图；
[0030]图5为本专利技术实施例的ECL显色图；
[0031]图6为本专利技术实施例的灰度分析结果；
[0032]图7为本专利技术实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种二联灭活疫苗相对效力的检测方法，其特征在于，所述二联灭活疫苗为猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗，所述二联灭活疫苗相对效力的检测方法包括：采用免疫印迹法，测定所述二联灭活疫苗的相对效力。2.如权利要求1所述的二联灭活疫苗相对效力的检测方法，其特征在于，步骤采用免疫印迹法，测定所述二联灭活疫苗的相对效力，包括：S10、制备多个不同浓度参考疫苗的变性蛋白样品，制备待测样品的变性蛋白样品，其中，所述参考疫苗包括猪圆环病毒2型参考疫苗和猪肺炎支原体参考疫苗；S20、SDS
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PAGE分离参考疫苗和待测样品变性蛋白样品中的Cap蛋白，SDS
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PAGE分离参考疫苗和待测样品变性蛋白样品中的P46蛋白；S30、将参考疫苗和待检样品的Cap蛋白从凝胶转移到PVDF膜上，得第一膜，将参考疫苗和待测样品的P46蛋白从凝胶转移到PVDF膜上，得第二膜；S40、将所述第一膜和所述第二膜封闭后，分别加特异性抗体和酶标第二抗体并孵育，对应得第一待测膜和第二待测膜；S50、将所述第一待测膜和所述第二待测膜显色后，分别测定灰度，并根据参考疫苗的灰度与对应浓度，获得标准曲线；S60、根据所述各待测样品的灰度，在标准曲线上获得待测样品的相对浓度，并依据所述待测样品的相对浓度和对应参考疫苗样品的相对浓度，获得待测样品的相对效力。3.如权利要求2所述的二联灭活疫苗相对效...

【专利技术属性】
技术研发人员：张飞雁，秦涛，朱薇，秦红刚，邓永欢，李晶梅，李健，郑佳，张敏，何珊，王威，谢红玲，石宝兰，漆世华，
申请(专利权)人：国药集团动物保健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：