用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，公开了一种用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡，所述检测卡包括顺次搭接粘贴于底板上的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，金标结合垫上吸附有胶体金标记的检测抗体，硝酸纤维素膜上由样品垫端至吸水垫端依次设有相互平行的检测线和质控线，检测线包被有捕获抗体，质控线包被有抗鼠二抗；检测抗体和捕获抗体均为抗MMP

【技术实现步骤摘要】
用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，更具体地涉及一种用于诊断胆道闭锁的胶体金快速 检测卡，本专利技术还涉及这种检测卡的制备方法。

技术介绍

[0002]胆道闭锁(Biliary Atresia，BA)是严重威胁婴幼儿生命的胆道梗阻性疾病。目 前认为该病主要由病毒引起，导致继发性的肝内外胆管梗阻、肝纤维化，直至形成肝硬 化并严重危及患儿生命，其确切的病理生理学机制尚未完全明确。如果得不到及时治疗， 进展性肝硬化会造成多数患儿在2岁内死亡。肝门肠吻合术(Kasai术)是目前治疗胆 道闭锁的主要方式，但手术时患儿的年龄起关键作用，手术成功率与患儿手术时的年龄 呈负相关。如能早期明确诊断并且施行手术可显著改善BA患儿预后，否则预后大多不 良，因此，对胆道闭锁做出早期诊断尤为重要。
[0003]现在对胆道闭锁的早期诊断尚缺乏行之有效的方法，只能依靠多项指标联合诊断， 过程繁琐费时耗力，大多数患儿在出生60天后才得以确诊，但已错过最佳治疗时机。 目前，有助于胆道闭锁早期诊断的筛查方法还在研究中，如血清胆汁酸、直接胆红素、 尿硫酸化胆汁酸、胆红素检测、肝活检、粪便比色卡和各种影像学方法等。其中术中胆 道造影及肝脏组织病理活检是诊断胆道闭锁的金标准，但是创伤较大、操作复杂、费用 高，难以应用于临床早期筛查。这些方法在有效性、灵敏度和特异性等方面尚未得到充 分评价或比较。因此，急需非损伤性的、特异性和敏感性高的指标和方法，实现对新生 儿胆道闭锁的快速、经济、有效的筛查和诊断。
[0004]有研究通过对BA/非BA胆汁淤积患儿进行细胞因子、趋化因子在内的120余种血清 分析物和蛋白酶检测后发现，与非BA胆汁淤积患儿的对照组相比，有17种分析物表达 呈现明显的差异，其中差异最大的为基质金属蛋白酶7(MMP
‑
7)。此外，在BA患儿中 检测出MMP
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2、MMP
‑
7、MMP
‑
9、MMP
‑
13等的表达，发现与同年龄无肝胆疾病的患儿相比， 仅MMP
‑
2及MMP
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7的表达量增高，且MMP
‑
7的表达是MMP
‑
2的4倍以上。因此，以MMP
‑
7 作为诊断胆道闭锁血清标志物具有巨大潜力和应用前景。
[0005]胶体金检测方法相较于现有的胆道闭锁诊断金标准方法以及基于免疫学原理的酶 联免疫吸附法，克服了需借助昂贵仪器设备、对检验操作人员专业要求高、检测过程繁 琐耗时、病人需遭受创伤痛苦和承受较大经济负担等劣势。但是，目前获取快速灵敏、 特异性高的基于MMP
‑
7的胆道闭锁诊断胶体金检测卡还存在技术上的难题。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的上述缺陷，本专利技术的第一目的在于提供一种用于诊断胆道闭锁的胶 体金快速检测卡，它解决现有的胆道闭锁诊断方法对仪器设备、检测人员专业要求高、 检测过程繁琐、耗时等问题。
[0007]本专利技术的第二目的在于提供上述用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡的制备
方 法。
[0008]为实现本专利技术的第一目的，本专利技术采用了如下的技术方案，一种用于诊断胆道闭锁 的胶体金快速检测卡，包括免疫胶体金试纸条，所述免疫胶体金试纸条包括顺次搭接粘 贴于底板上的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标结合垫上吸附有 胶体金标记的检测抗体，所述硝酸纤维素膜上由样品垫端至吸水垫端依次设有相互平行 的检测线和质控线，所述检测线包被有捕获抗体，所述质控线包被有检测抗体，所述的 检测抗体为抗鼠二抗；
[0009]所述检测抗体和所述捕获抗体的制备方法为：利用真核哺乳动物细胞表达并纯化 MMP
‑
7重组蛋白，将所述MMP
‑
7重组蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠，取免疫后 小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基进行培养后，用蛋白质印迹 法筛选验证阳性细胞，经有限稀释法克隆，再用ELISA筛选出两株分泌高亲和力单克隆 抗体的杂交瘤细胞株；将两株所述杂交瘤细胞株分别注射入经液体石蜡处理过的BALB/c 小鼠腹腔，待小鼠腹部明显隆起，取小鼠腹水，通过辛酸
‑
硫酸铵沉淀法初步纯化腹水， 再经亲和层析纯化得到两株抗MMP
‑
7单克隆抗体，其中一株作为检测抗体，另一株作为 捕获抗体；
[0010]所述胶体金标记的检测抗体的制备方法为：在胶体金溶液中加入碳酸钾调节pH至 8.0后，边搅拌边滴加所述检测抗体，搅拌一段时间后再加入质量浓度为10％的牛血清 白蛋白至终浓度为1％，继续搅拌，离心弃上清液，沉淀用0.01mol/L pH9.0的Tris缓 冲液重悬，得到胶体金标记的检测抗体。
[0011]在上述技术方案中，所述胶体金标记的检测抗体在所述金标结合垫上的用量为 4μL/cm，所述胶体金标记后的抗体终浓度为20μg/ml。
[0012]在上述技术方案中，所述捕获抗体的浓度为1.0mg/mL
‑
2.0mg/mL，其在所述检测线 处的用量为1μL/cm；
[0013]所述抗鼠二抗的浓度为0.5mg/mL
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1.5mg/mL，其在所述质控线处的用量为1μL/cm。
[0014]在上述技术方案中，所述抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体。
[0015]在上述技术方案中，所述样品垫和所述金标结合垫的材料为聚酯纤维或玻璃纤维。
[0016]在上述技术方案中，所述胶体金快速检测卡还包括卡壳，所述卡壳由支撑背板和盖 设于所述支撑背板的壳罩组成，所述免疫胶体金试纸条收容于所述支撑背板与所述壳罩 围成的空间内，所述支撑背板与所述底板远离所述样品垫的一面固定连接，所述壳罩上 设置有加样孔和检测视窗，所述加样孔与所述样品垫的加样端相对应，所述检测视窗与 所述检测线和所述质控线相对应。
[0017]本专利技术的第二目的在于提供上述制备用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡的方 法，包括如下步骤：
[0018]将胶体金标记的检测抗体喷涂于所述金标结合垫上，烘干，备用；
[0019]将捕获抗体和抗鼠二抗分别喷涂在所述硝酸纤维素膜上检测线和质控线所处的位 置；
[0020]将样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于底板上，各搭接处部分 重合，切割成预设宽度，得到免疫胶体金试纸条。
[0021]优选地，所述样品垫和所述金标结合垫均经缓冲液处理，所述缓冲液为含1％(w/
v) 牛血清白蛋白、3％(w/v)蔗糖、1％(w/v)吐温
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20和0.5％(w/v)聚乙烯醇的50mmol/L 的PBS溶液，其pH为7.2。
[0022]在上述技术方案中，所述制备方法还包括，将免疫胶体金试纸条放置于卡壳中，所 述卡壳由支撑背板和盖设于所述支撑背板本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡，其特征在于：包括免疫胶体金试纸条，所述免疫胶体金试纸条包括顺次搭接粘贴于底板上的样品垫(6)、金标结合垫(8)、硝酸纤维素膜(9)和吸水垫(10)，所述金标结合垫(8)上吸附有胶体金标记的检测抗体，所述硝酸纤维素膜(9)上由样品垫(6)端至吸水垫(10)端依次设有相互平行的检测线(3)和质控线(4)，所述检测线(3)包被有捕获抗体，所述质控线(4)包被有检测抗体，所述的检测抗体为抗鼠二抗；所述检测抗体和所述捕获抗体通过以下方法制备得到：利用真核哺乳动物细胞表达并纯化MMP
‑
7重组蛋白，将所述MMP
‑
7重组蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基进行培养后，用蛋白质印迹法筛选验证阳性细胞，经有限稀释法克隆，再用ELISA筛选出两株分泌高亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞株；将两株所述杂交瘤细胞株分别注射入经液体石蜡处理过的BALB/c小鼠腹腔，待小鼠腹部明显隆起，取小鼠腹水，通过辛酸
‑
硫酸铵沉淀法初步纯化腹水，再经亲和层析纯化得到两株抗MMP
‑
7单克隆抗体，其中一株作为检测抗体，另一株作为捕获抗体；所述胶体金标记的检测抗体通过以下方法制备得到：在胶体金溶液中加入碳酸钾调节pH至8.0后，边搅拌边滴加所述检测抗体，搅拌一段时间后再加入质量浓度为10％的牛血清白蛋白至终浓度为1％，继续搅拌，离心弃上清液，沉淀用0.01mol/L pH9.0的Tris缓冲液重悬，得到胶体金标记的检测抗体。2.根据权利要求1所述的用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡，其特征在于：所述胶体金标记的检测抗体在所述金标结合垫(8)上的用量为4μL/cm，所述胶体金标记后的抗体终浓度为20μg/ml。3.根据权利要求2所述的用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡，其特征在于：所述捕获抗体的浓度为1.0mg/mL
‑
2.0mg/mL，其在所述检测线处的用量为1μL/cm；所述抗鼠二抗的浓度为0.5mg/mL
‑
1.5mg/mL，其在所述质控线...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤绍涛，蔡从利，赵骞，池水清，华俊清，曹国庆，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：