一种试剂盒及其制备方法以及应用技术

本发明专利技术公开了一种试剂盒及其制备方法以及应用，用于检测PRRSV的含量，所述试剂盒包括：PRRSV标准品、阴性对照液、阳性对照液、酶标板、抗体溶液及辅助试剂；所述酶标版为抗PRRSV多克隆抗体包被的酶标板；所述抗体溶液为HRP标记的抗PRRSV单克隆抗体溶液；所述辅助试剂包括洗涤液、稀释液、终止液、底物液。本发明专利技术的试剂盒操作简单快捷，相对传统的TCID

【技术实现步骤摘要】
一种试剂盒及其制备方法以及应用


[0001]本专利技术涉及试剂盒
，尤其涉及一种试剂盒及其制备方法以及应用，特别涉及用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒含量的快速检测试剂盒。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory Syndrome，PRRS)由PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)引起，自二十世纪八十年代末期开始流行，1992年国际兽医局正式命名，主要感染猪，尤其是母猪，该病严重影响其生殖功能，临床主要特征为流产，产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难，在发病过程中会出现短暂性的两耳皮肤紫绀，故又称为蓝耳病。猪繁殖与呼吸综合征是由PRRSV以妊娠母猪繁殖及各种年龄猪，特别是仔猪的呼吸道疾病为特征的一种严重的传染性疫病，并已遍布全世界主要养猪国家和地区，成为威胁养猪业健康发展的主要疫病之一。
[0003]疫苗免疫是防控猪繁殖与呼吸综合征的重要手段，在猪繁殖与呼吸综合征疫苗的生产中，抗原含量是疫苗质控的重要指标，目前测定抗原含量的方法主要是采用组织细胞半数感染量TCID
50
，该方式耗时长，至少需要72h；而且病毒的毒力以其致细胞病变效应(cytopathic effect CPE)的程度确定，即观察病毒致细胞病变的最高和最低量，以半数细胞病变为病毒感染剂量，因此只能检测有活性的病毒，而在灭活疫苗的生产中，病毒灭活之后不能采用该方法测定病毒含量，给疫苗质控造成一定的短板。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的是提出一种用于检测PRRSV含量的快速检测试剂盒，旨在解决现有技术中检测病毒耗时长，不能检测灭活病毒的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提出一种试剂盒，用于检测PRRSV的含量，所述试剂盒包括：
[0006]PRRSV标准品；
[0007]阴性对照液；
[0008]阳性对照液；
[0009]酶标板，所述酶标版为抗PRRSV多克隆抗体包被的酶标板；
[0010]抗体溶液，所述抗体溶液为HRP标记的抗PRRSV单克隆抗体溶液；以及，
[0011]辅助试剂，包括洗涤液、稀释液、终止液、底物液。
[0012]可选地，所述阴性对照液为Marc
‑
145细胞培养液；和/或，
[0013]所述阳性对照液为灭活的PRRSV溶液；和/或，
[0014]所述洗涤液为磷酸盐及吐温20混合液；和/或，
[0015]所述稀释液为磷酸盐缓冲液；和/或，
[0016]所述底物液包括底物液A和底物液B，所述底物液A为乙酸钠溶液，所述底物液B为3,3
’
,5,5
’‑
四甲基联苯胺、乙酸钠以及二甲亚砜的混合水溶液和/或；
[0017]所述终止液为硫酸溶液。
[0018]本专利技术还提出了一种试剂盒的制备方法，所述试剂盒包括：PRRSV标准品、阴性对照液、阳性对照液、酶标板、抗体溶液及辅助试剂；所述酶标版为抗PRRSV多克隆抗体包被的酶标板；所述抗体溶液为HRP标记的抗PRRSV单克隆抗体溶液；所述辅助试剂包括洗涤液、稀释液、终止液、底物液，所述制备方法包括以下步骤：
[0019]配制辅助试剂；
[0020]酶标板制备，制备抗PRRSV多克隆抗体，将抗PRRSV多克隆抗体经包被液稀释处理后加入酶标板，包被处理后，再经封闭液封闭处理，得抗PRRSV多克隆抗体包被的酶标板；
[0021]PRRSV标准品制备；
[0022]阳性对照液制备；
[0023]阴性对照液制备；
[0024]抗体溶液制备，制备抗PRRSV单克隆抗体，将抗PRRSV单克隆抗体溶液进行HRP标记后配制成溶液，得HRP标记的抗PRRSV单克隆抗体溶液；
[0025]试剂盒组装，将PRRSV标准品、阴性对照液、阳性对照液、酶标板、抗体溶液、辅助试剂等，组装成试剂盒。
[0026]可选地，所述酶标板制备步骤中，
[0027]所述抗PRRSV多克隆抗体经包被液稀释处理后，浓度为0.25～8μg/mL。
[0028]可选地，所述酶标板制备步骤中，所述封闭液包括BSA、脱脂奶、酪蛋白及明胶中的任意一种。
[0029]本专利技术还提出了一种PRRSV含量的检测方法，采用上述的试剂盒，所述试剂盒包括：PRRSV标准品、阴性对照液、阳性对照液、酶标板、抗体溶液及辅助试剂；所述酶标版为抗PRRSV多克隆抗体包被的酶标板；所述抗体溶液为HRP标记的抗PRRSV单克隆抗体溶液；所述辅助试剂包括洗涤液、稀释液、底物液、终止液，所述PRRSV含量的检测方法包括以下步骤：
[0030]S1、对PRRSV标准品、待测样品、阴性对照液、阳性对照液及抗体溶液分别用稀释液进行稀释，对应得稀释后的PRRSV标准品、稀释后的待测样品、稀释后的阴性对照液、稀释后的阳性对照液及稀释后的抗体溶液；
[0031]S2、将稀释后的PRRSV标准品、稀释后的待测样品、稀释后的阴性对照液及稀释后的阳性对照液分别加入酶标板中，经第一次孵育、洗涤液清洗、干燥后，分别加入稀释后的抗体溶液，经第二次孵育、洗涤液清洗、干燥后，分别加入底物液避光反应，然后分别加入终止液，得待测酶标板；
[0032]S3、将待测酶标板进行吸光度值测定，根据吸光度值，计算出待测样品的PRRSV含量。
[0033]可选地，步骤S1中：
[0034]所述PRRSV标准品和待测样品分别用稀释液进行1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256倍稀释；和/或，
[0035]阴性对照液和阳性对照液分别用稀释液按1:10稀释；和/或，
[0036]抗体溶液用稀释液按1∶(1 000～128 000)稀释。
[0037]可选地，步骤S2中：
[0038]第一次孵育的孵育温度为36～38℃，孵育时间为30～120min；和/或
[0039]第二次孵育的孵育温度为36～38℃，孵育时间为30～120min。
[0040]可选地，步骤S2中：
[0041]所述避光反应时间为5～20min。
[0042]可选地，步骤S3中：
[0043]所述测定吸光度值的波长为450nm。
[0044]本专利技术提供一种试剂盒，用于检测PRRSV的含量，所述试剂盒包括：PRRSV标准品、阴性对照液、阳性对照液、酶标板、抗体溶液及辅助试剂；所述酶标版为抗PRRSV多克隆抗体包被的酶标板；所述抗体溶液为HRP标记的抗PRRSV单克隆抗体溶液；所述辅助试剂包括洗涤液、稀释液、终止液、底物液。
[0045]本专利技术的试剂盒操作简单快捷，相对传统的TCID
50
测定方法，可准确、快捷定量检测灭活前和灭活后的PRRSV含量，同时减少检测所需时间。本专利技术采用双抗体夹心法，通过在酶标板表面进行抗PRRSV多克隆抗体包被，使抗PRRS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其特征在于，用于检测PRRSV的含量，所述试剂盒包括：PRRSV标准品；阴性对照液；阳性对照液；酶标板，所述酶标版为抗PRRSV多克隆抗体包被的酶标板；抗体溶液，所述抗体溶液为HRP标记的抗PRRSV单克隆抗体溶液；以及，辅助试剂，包括洗涤液、稀释液、终止液、底物液。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照液为Marc
‑
145细胞培养液；和/或，所述阳性对照液为灭活的PRRSV溶液；和/或，所述洗涤液为磷酸盐及吐温20混合液；和/或，所述稀释液为磷酸盐缓冲液；和/或，所述终止液为硫酸溶液；和/或，所述底物液包括底物液A和底物液B，所述底物液A为乙酸钠溶液，所述底物液B为3,3
’
,5,5
’‑
四甲基联苯胺、乙酸钠以及二甲亚砜的混合水溶液。3.一种如权利要求1或2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：配制辅助试剂；酶标板制备，制备抗PRRSV多克隆抗体，将抗PRRSV多克隆抗体经包被液稀释处理后加入酶标板，包被处理后，再经封闭液封闭处理，得抗PRRSV多克隆抗体包被的酶标板；PRRSV标准品制备；阳性对照液制备；阴性对照液制备；抗体溶液制备，制备抗PRRSV单克隆抗体，将抗PRRSV单克隆抗体溶液进行HRP标记后配制成溶液，得HRP标记的抗PRRSV单克隆抗体溶液；试剂盒组装，将PRRSV标准品、阴性对照液、阳性对照液、酶标板、抗体溶液、辅助试剂等，组装成试剂盒。4.如权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述酶标板制备的步骤中，所述抗PRRSV多克隆抗体经包被液稀释处理后，浓度为0.25～8μg/mL。5.如权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述酶标板制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：周敏，秦红刚，韩兴，秦伟，熊亮，张飞雁，李建，徐芳，李凌峰，石宝兰，谢红玲，舒银辉，漆世华，
申请(专利权)人：国药集团动物保健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：