一种新冠病毒的重组猫疱疹病毒的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种新冠病毒的重组猫疱疹病毒的制备方法及其应用，所述新冠病毒的重组猫疱疹病毒的制备方法包括以下步骤：将质粒pUC19用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，得到线性化pUC19质粒片段；从FHV

【技术实现步骤摘要】
一种新冠病毒的重组猫疱疹病毒的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及重组病毒
，具体涉及一种新冠病毒的重组猫疱疹病毒的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒具有高度的传染性，各国针对猫群大规模血清学筛查较少，发现的猫感染病例仅限于阳性病例密切接触的家养猫和几个地区大规模流行区的家猫，并且没有针对性的疫苗用于预防猫的感染。

技术实现思路

[0003]本专利技术的主要目的是提出一种新冠病毒的重组猫疱疹病毒的制备方法及其应用，旨在获得重组猫疱疹病毒，重组猫疱疹病毒进入体内后翻译表达型冠状病毒刺突蛋白，刺激机体产生免疫反应。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提出一种新冠病毒的重组猫疱疹病毒的制备方法，所述新冠病毒的重组猫疱疹病毒的制备方法包括以下步骤：
[0005]将质粒pUC19用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，得到线性化pUC19质粒片段；
[0006]从FHV
‑
1病毒基因组DNA中扩增出左臂和右臂，以质粒pUC
‑
RBD为模板扩增出SARS
‑
CoV
‑
2的RBD基因，以pT
‑
EGFP质粒为模板扩增出CMV基因启动子、2A自剪切多肽、EGFP ORF和SV40 polyA信号；
[0007]将所述左臂、所述CMV基因启动子和所述RBD基因连接，得到LgI
‑
CMV
‑
RBD，将所述2A自剪切多肽、所述EGFP ORF和所述SV40 polyA信号连接，得到2A
‑
EGFP
‑
SV40 polyA
‑
RgE；
[0008]将所述LgI
‑
CMV
‑
RBD的同源臂LgI、所述2A
‑
EGFP
‑
SV40 polyA
‑
RgE的同源臂RgE与所述线性化pUC19质粒片段连接，获得重组质粒pUC19
‑
RBD
‑
EGFP；
[0009]在所述重组质粒pUC19
‑
RBD
‑
EGFP基础上再进行PstⅠ和PacⅠ双酶切改造，得到pUC
‑
EGFP线性化片段；
[0010]以合成的质粒pUC
‑
S1/S为模板扩增SARS
‑
CoV
‑
2的S1基因以及S基因，将所述S1基因与BGH polyA启动子连接，获得S1
‑
BGH polyA
‑
RSV片段，将所述S基因与RSV启动子连接，获得S
‑
BGH polyA
‑
RSV片段；
[0011]将所述pUC
‑
EGFP线性化片段分别与所述S1
‑
BGH polyA
‑
RSV片段和所述S
‑
BGH polyA
‑
RSV片段连接，对应获得重组质粒pUC19
‑
S1
‑
EGFP和pUC19
‑
S
‑
EGFP；
[0012]将所述重组质粒pUC19
‑
RBD
‑
EGFP、pUC19
‑
S1
‑
EGFP和pUC19
‑
S
‑
EGFP分别与病毒共转染F81细胞，得到转染的F81细胞；
[0013]待所述转染的F81细胞中出现绿色荧光细胞出现且细胞病变灶占比75％～85％时，冻融，获得病毒液；
[0014]将所述病毒液进行病毒空斑纯化5
‑
6代，无菌操作挑取带绿色荧光病变灶，冻融后进行稀释，重复所述病毒空斑纯化直至病变细胞均呈绿色荧光，所有病毒斑都是由重组病
毒引起的，获得新冠病毒的重组猫疱疹病毒。
[0015]可选地，在将所述重组质粒pUC19
‑
RBD
‑
EGFP、pUC19
‑
S1
‑
EGFP和pUC19
‑
S
‑
EGFP分别与病毒共转染F81细胞，得到转染的F81细胞的步骤中，所述病毒为猫疱疹病毒FHV
‑
1。
[0016]可选地，所述新冠病毒的重组猫疱疹病毒包括rFHV
‑
RBD、rFHV
‑
S1和rFHV
‑
S之中的至少一种。
[0017]可选地，在步骤将所述左臂、所述CMV基因启动子和所述RBD基因连接，得到LgI
‑
CMV
‑
RBD，将所述2A自剪切多肽、所述EGFP ORF和所述SV40polyA连接，得到2A
‑
EGFP
‑
SV40 polyA
‑
RgE中，所述左臂、所述CMV基因启动子和所述RBD基因采用Overlap PCR方法连接。
[0018]可选地，在步骤将所述LgI
‑
CMV
‑
RBD的同源臂LgI、所述2A
‑
EGFP
‑
SV40polyA
‑
RgE的同源臂RgE与所述线性化pUC19质粒片段连接，获得重组质粒pUC19
‑
RBD
‑
EGFP中，采用infusion的方法，将所述LgI
‑
CMV
‑
RBD的同源臂LgI、所述2A
‑
EGFP
‑
SV40 polyA
‑
RgE的同源臂RgE与所述线性化pUC19质粒片段连接。
[0019]本专利技术还提出一种猫疱疹病毒疫苗，所述猫疱疹病毒疫苗由如上所制备的新冠病毒的重组猫疱疹病毒制得。
[0020]本专利技术还提出一种猫疱疹病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：将如上所制备的新冠病毒的重组猫疱疹病毒重悬于PBS/DMEM中培养，获得猫疱疹病毒疫苗。
[0021]本专利技术提供的技术方案中，首先构建载体时，使用双酶切质粒，提高连接效率、避免载体自身环化同时控制外源基因的插入方向，然后使用同种病毒扩增出同源臂，以识别重组区域，接着选用特定启动子，控制基因表达的起始和表达程度，然后通过共转染使病毒基因在肾细胞内表达，最后进行纯化得到猫疱疹病毒，重组猫疱疹病毒进入体内后翻译表达型冠状病毒刺突蛋白，刺激机体产生免疫反应。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新冠病毒的重组猫疱疹病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将质粒pUC19用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，得到线性化pUC19质粒片段；从FHV
‑
1病毒基因组DNA中扩增出左臂和右臂，以质粒pUC
‑
RBD为模板扩增出SARS
‑
CoV
‑
2的RBD基因，以pT
‑
EGFP质粒为模板扩增出CMV基因启动子、2A自剪切多肽、EGFP ORF和SV40 polyA信号；将所述左臂、所述CMV基因启动子和所述RBD基因连接，得到LgI
‑
CMV
‑
RBD，将所述2A自剪切多肽、所述EGFP ORF和所述SV40 polyA信号连接，得到2A
‑
EGFP
‑
SV40 polyA
‑
RgE；将所述LgI
‑
CMV
‑
RBD的同源臂LgI、所述2A
‑
EGFP
‑
SV40 polyA
‑
RgE的同源臂RgE与所述线性化pUC19质粒片段连接，获得重组质粒pUC19
‑
RBD
‑
EGFP；在所述重组质粒pUC19
‑
RBD
‑
EGFP基础上再进行PstⅠ和PacⅠ双酶切改造，得到pUC
‑
EGFP线性化片段；以合成的质粒pUC
‑
S1/S为模板扩增SARS
‑
CoV
‑
2的S1基因以及S基因，将所述S1基因与BGH polyA启动子连接，获得S1
‑
BGH polyA
‑
RSV片段，将所述S基因与RSV启动子连接，获得S
‑
BGH polyA
‑
RSV片段；将所述pUC
‑
EGFP线性化片段分别与所述S1
‑
BGH polyA
‑
RSV片段和所述S
‑
BGH polyA
‑
RSV片段连接，对应获得重组质粒pUC19
‑
S1
‑
EGFP和pUC19
‑
S
‑
EGFP；将所述重组质粒pUC19
‑
RBD
‑
EGFP、pUC19
‑
S1
‑
EGFP和pUC19
‑
S
‑
EGFP分别与病毒共转染...

【专利技术属性】
技术研发人员：漆世华，于义娟，谢红玲，石宝兰，李婷婷，黄涛，付宁宁，
申请(专利权)人：国药集团动物保健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：